Charlotte's journal.xml

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8" standalone="yes"?>
<?mso-application progid="Word.Document"?>
<pkg:package xmlns:pkg="http://schemas.microsoft.com/office/2006/xmlPackage"><pkg:part pkg:name="/_rels/.rels" pkg:contentType="application/vnd.openxmlformats-package.relationships+xml" pkg:padding="512"><pkg:xmlData><Relationships xmlns="http://schemas.openxmlformats.org/package/2006/relationships"><Relationship Id="rId3" Type="http://schemas.openxmlformats.org/officeDocument/2006/relationships/extended-properties" Target="docProps/app.xml"/><Relationship Id="rId2" Type="http://schemas.openxmlformats.org/package/2006/relationships/metadata/core-properties" Target="docProps/core.xml"/><Relationship Id="rId1" Type="http://schemas.openxmlformats.org/officeDocument/2006/relationships/officeDocument" Target="word/document.xml"/></Relationships></pkg:xmlData></pkg:part><pkg:part pkg:name="/word/_rels/document.xml.rels" pkg:contentType="application/vnd.openxmlformats-package.relationships+xml" pkg:padding="256"><pkg:xmlData><Relationships xmlns="http://schemas.openxmlformats.org/package/2006/relationships"><Relationship Id="rId3" Type="http://schemas.openxmlformats.org/officeDocument/2006/relationships/settings" Target="settings.xml"/><Relationship Id="rId2" Type="http://schemas.openxmlformats.org/officeDocument/2006/relationships/styles" Target="styles.xml"/><Relationship Id="rId1" Type="http://schemas.openxmlformats.org/officeDocument/2006/relationships/numbering" Target="numbering.xml"/><Relationship Id="rId6" Type="http://schemas.openxmlformats.org/officeDocument/2006/relationships/theme" Target="theme/theme1.xml"/><Relationship Id="rId5" Type="http://schemas.openxmlformats.org/officeDocument/2006/relationships/fontTable" Target="fontTable.xml"/><Relationship Id="rId4" Type="http://schemas.openxmlformats.org/officeDocument/2006/relationships/webSettings" Target="webSettings.xml"/></Relationships></pkg:xmlData></pkg:part><pkg:part pkg:name="/word/document.xml" pkg:contentType="application/vnd.openxmlformats-officedocument.wordprocessingml.document.main+xml"><pkg:xmlData><w:document mc:Ignorable="w14 w15 wp14" xmlns:wpc="http://schemas.microsoft.com/office/word/2010/wordprocessingCanvas" xmlns:mc="http://schemas.openxmlformats.org/markup-compatibility/2006" xmlns:o="urn:schemas-microsoft-com:office:office" xmlns:r="http://schemas.openxmlformats.org/officeDocument/2006/relationships" xmlns:m="http://schemas.openxmlformats.org/officeDocument/2006/math" xmlns:v="urn:schemas-microsoft-com:vml" xmlns:wp14="http://schemas.microsoft.com/office/word/2010/wordprocessingDrawing" xmlns:wp="http://schemas.openxmlformats.org/drawingml/2006/wordprocessingDrawing" xmlns:w10="urn:schemas-microsoft-com:office:word" xmlns:w="http://schemas.openxmlformats.org/wordprocessingml/2006/main" xmlns:w14="http://schemas.microsoft.com/office/word/2010/wordml" xmlns:w15="http://schemas.microsoft.com/office/word/2012/wordml" xmlns:wpg="http://schemas.microsoft.com/office/word/2010/wordprocessingGroup" xmlns:wpi="http://schemas.microsoft.com/office/word/2010/wordprocessingInk" xmlns:wne="http://schemas.microsoft.com/office/word/2006/wordml" xmlns:wps="http://schemas.microsoft.com/office/word/2010/wordprocessingShape"><w:body><w:p w:rsidR="00925CB2" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="002A750C" w:rsidP="002A750C"><w:pPr><w:jc w:val="center"/></w:pPr><w:bookmarkStart w:id="0" w:name="_GoBack"/><w:bookmarkEnd w:id="0"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve">Charlotte Bourg </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>iGEM</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve"> Journal</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A750C" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="002A750C" w:rsidP="002A750C"><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>6/1/15</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A750C" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00754E18" w:rsidP="002A750C"><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>Fill in from journal</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00754E18" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00754E18" w:rsidP="002A750C"><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>6/2/15</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00754E18" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00754E18" w:rsidP="002A750C"><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>Make 1.5 liters of Luria-</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>Bertani</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve"> (LB) agar and 1.5 liters of LB media</w:t></w:r><w:r w:rsidR="007F561C" w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve"> (in Zhang lab)</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00754E18" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00754E18" w:rsidP="00754E18"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="1"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>Recipe for 1 liter of total volume of LB:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00754E18" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00754E18" w:rsidP="00754E18"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="1"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>5</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>g of yeast extract</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00754E18" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00754E18" w:rsidP="00754E18"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="1"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>10</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve">g of </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>NaCl</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/></w:p><w:p w:rsidR="00754E18" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00754E18" w:rsidP="00754E18"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="1"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>10</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve">g of </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>tryptone</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/></w:p><w:p w:rsidR="00754E18" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00754E18" w:rsidP="00754E18"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="1"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>15</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>g of agar (for LB agar only)</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00754E18" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00754E18" w:rsidP="00754E18"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="1"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>add 2</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>L of water to a flask with 15</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>g yeast extract, 30</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve">g </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>NaCl</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>, and 30</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve">g </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>tryptone</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/></w:p><w:p w:rsidR="00754E18" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00754E18" w:rsidP="00754E18"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="1"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>stir until dissolved</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00754E18" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00754E18" w:rsidP="00754E18"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="1"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>add 500 mL of the dissolved solution to each of 3 bottles with 7.5</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>mL of agar</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00754E18" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00754E18" w:rsidP="00754E18"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="1"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>divide the remaining solution between 2 1-L bottles</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00754E18" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00754E18" w:rsidP="00754E18"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="1"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>autoclave the bottles:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00754E18" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00754E18" w:rsidP="00754E18"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="1"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>loosen the lid of the bottles slightly</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00754E18" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00754E18" w:rsidP="00754E18"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="1"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>put autoclave tape crossing from the bottle onto the lid—can move to the lid later</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="007F561C" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00754E18" w:rsidP="007F561C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="1"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>place sensor in a flask of water (would leave sensor in holder for hard goods)</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="007F561C" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="007F561C" w:rsidP="007F561C"><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve">Make overnight cultures from frozen stock to make </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>electrocompetent</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve"> cells the next day (in Moon lab):</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="007F561C" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="007F561C" w:rsidP="007F561C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="2"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>strains: JM109 and MG1655</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="007F561C" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="007F561C" w:rsidP="007F561C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="2"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve">from glycerol stock, </w:t></w:r><w:r w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403"><w:t>set up two 50mL cultures in 250-</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>mL flasks</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="007F561C" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="007F561C" w:rsidP="007F561C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="2"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve">grow </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>overnight</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="007F561C" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="007F561C" w:rsidP="007F561C"><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>6/3/15</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="007F561C" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="007F561C" w:rsidP="007F561C"><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>Electrocompetent</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve"> prep of JM109 and MG1655 (in Moon lab):</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="007F561C" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="007F561C" w:rsidP="007F561C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>add 25</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>mL of each culture (JM109 and MG1655) into 500 mL of LB in a 2</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>L flask</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="007F561C" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="007F561C" w:rsidP="007F561C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>grow at 37</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C and 250 rpm for ~1 hour</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="007F561C" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="007F561C" w:rsidP="007F561C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>started at ~10:33</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>am, taken out at ~11:35</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>am</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="007F561C" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="007F561C" w:rsidP="007F561C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>add a 10x dilution into cuvettes</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="007F561C" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="007F561C" w:rsidP="007F561C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>900</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of H</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/><w:vertAlign w:val="subscript"/></w:rPr><w:t>2</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">0 and 100 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of JM109</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="007F561C" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="007F561C" w:rsidP="007F561C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>900</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of H</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/><w:vertAlign w:val="subscript"/></w:rPr><w:t>2</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">0 and 100 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of MG1655</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="007F561C" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="007F561C" w:rsidP="007F561C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="2"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Mix each with the </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>pipetter</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/></w:p><w:p w:rsidR="007F561C" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="007F561C" w:rsidP="007F561C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>blank cuvette: 1</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>mL of water</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="007F561C" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="007F561C" w:rsidP="007F561C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="2"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>avoid touching the bottom area of the cuvettes</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="007F561C" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="007F561C" w:rsidP="007F561C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>take the OD</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/><w:vertAlign w:val="subscript"/></w:rPr><w:t>600</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="007F561C" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="007F561C" w:rsidP="007F561C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">open </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>i</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>-control application and use file “cuvette 600”</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="007F561C" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="007F561C" w:rsidP="007F561C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="2"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>specific to Moon lab</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00517E90" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00517E90" w:rsidP="00517E90"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>click “apply blanking” and start blanking, then take measurements of other 2 cuvettes</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00517E90" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="007F561C" w:rsidP="00517E90"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>JM109 has OD .287</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="007F561C" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="007F561C" w:rsidP="007F561C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:lastRenderedPageBreak/><w:t>MG1655 has OD .390</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00517E90" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00517E90" w:rsidP="007F561C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Desired range: 0.35 to 0.4</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00517E90" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00517E90" w:rsidP="00517E90"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="2"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Put JM109 flask back in incubator for ~15 minutes starting at 11:56</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>am to try to increase OD</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00517E90" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00517E90" w:rsidP="00517E90"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="2"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Leave MG1655 on bench top (growing more slowly)</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00517E90" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00517E90" w:rsidP="00517E90"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>Second measurement of OD of JM109: 0.375</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00517E90" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00517E90" w:rsidP="00517E90"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>In cold (4</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C) room, evenly distribute each culture into 2 centrifuge bottles (total of 4 bottles) and place in an ice bucket. Wait for 15-30 minutes.</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00517E90" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00517E90" w:rsidP="00517E90"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Placed on ice at ~12:30</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>pm</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00517E90" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00517E90" w:rsidP="00517E90"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Keep on ice and bring bottles to centrifuge. Set at 4°C and 3000</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>rpm for 25 minutes</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00517E90" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00517E90" w:rsidP="00517E90"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Return to cold room and discard supernatant by pouring quickly and gently </w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00517E90" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00517E90" w:rsidP="00517E90"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Suspend with total 500 mL of water (125</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>mL each bottle) and swirl until pellet disappears</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00517E90" w:rsidP="00054359"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Centrifuge at 4°C</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> and 3000 rpm for 25 minutes</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00054359" w:rsidP="00054359"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>In cold room, discard liquid and suspend pellet gently (by swirling) with total 220 mL of 10% glycerol (55 mL each bottle) until you do not see pellet</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00054359" w:rsidP="00054359"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Aliquot contents of each bottle into 4 15-mL conical tubes (16 tubes total)</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00054359" w:rsidP="00054359"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Centrifuge at 4°C and 3000 rpm for 25 minutes</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00054359" w:rsidP="00054359"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>In cold room, pour off the liquid and pipette out the remaining liquid</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00054359" w:rsidP="00054359"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Resuspend</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> pellets in 1 mL glycerol in each tube, then combine into 1 tube per strain</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00054359" w:rsidP="00054359"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Centrifuge at 4°C and 3000 rpm for 25 minutes</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00054359" w:rsidP="00054359"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>In cold room pour out liquid and pipette of remaining liquid</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00054359" w:rsidP="00054359"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 1.5 mL of 10% glycerol to each tube and </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>resuspend</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/></w:p><w:p w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00054359" w:rsidP="00054359"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="3"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Aliquot 40 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> each into small labeled vials and place in a labeled box in the -80°C freezer</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00054359" w:rsidP="00054359"><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>Transformation (in Moon lab):</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00054359" w:rsidP="00054359"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="4"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve">Take MG1655 and WM1788 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>electrocompetent</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t xml:space="preserve"> cells out of -80</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C and place on ice</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00054359" w:rsidP="00054359"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="4"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Take PSL2397 (plasmid) out of -80°C and place on ice</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00054359" w:rsidP="00054359"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="4"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 2 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of PSL2397 directly into MG1655 tube</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00054359" w:rsidP="00054359"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="4"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Just add; do not draw back up and down with pipette</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="006E68E7" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="006E68E7" w:rsidP="006E68E7"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="4"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Set pipette over 40 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> and draw up the MG1655 and PSL2397 mixture and place into electroporation cuvette </w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="006E68E7" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="006E68E7" w:rsidP="006E68E7"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="4"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Tap cuvette to ensure cells are at bottom of cuvette—should check to see that there are no gaps—and place into </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>electroporator</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>; turn on</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="006E68E7" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="006E68E7" w:rsidP="006E68E7"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="4"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Immediately add 500 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of LB into the cuvette then pour into culture tube</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="006E68E7" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="006E68E7" w:rsidP="006E68E7"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="4"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Place culture tube into incubator for 1 hour </w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="006E68E7" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="006E68E7" w:rsidP="006E68E7"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="4"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">MG1655 placed into incubator at 4:58 pm and had time constant of 5.5 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>ms</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/></w:p><w:p w:rsidR="006E68E7" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="006E68E7" w:rsidP="006E68E7"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="4"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Repeat with WM1788</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="006E68E7" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="006E68E7" w:rsidP="006E68E7"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="4"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Placed into incubator at 5:04 pm and had time constant of 5.3 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>ms</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/></w:p><w:p w:rsidR="00054359" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="00054359" w:rsidP="006E68E7"/><w:p w:rsidR="006E68E7" w:rsidRPr="00584403" w:rsidRDefault="006E68E7" w:rsidP="006E68E7"><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:t>6/4/15</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10"><w:r><w:t>Isolate plasmid (Zhang lab):</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:lastRenderedPageBreak/><w:t>Work within 30 cm of flame and flame lip of glass flask at opening and closing</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:t>Add 50 mL of LB to conical 50 ml tube</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRPr="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:t xml:space="preserve">Add 50 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of chloramphenicol and mix </w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRPr="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Pour into 125 mL flask</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRPr="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 1.5 mL of PA2C-TesA (cells with plasmid to be isolated) with a 1000 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> pipette</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRPr="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Place flask on shaker in warm room at 250 rpm (200 to 250 rpm in standard for E. coli)</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRPr="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Placed on shaker at 9:20 am – leave there until ~ 2 or 3 pm</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRPr="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Took out of warm room/off shaker at 2:12pm</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRPr="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Pour into a 50 mL conical tube</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRPr="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Centrifuge until supernatant is clear and then pour off supernatant</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRPr="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 2.5 mL of resuspension buffer and pipette in and out to </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>resuspend</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> until no pellet remains</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRPr="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Add 2.75 mL of lysis buffer and invert a few times to mix</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRPr="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Solution is now viscous</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRPr="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Add 4 mL of neutralization buffer and invert a few times to mix</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRPr="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Solution is cloudy</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRPr="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Centrifuge at 4700 rpm for 15 minutes</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRPr="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Supernatant not completely clear after centrifuging, but that is fine because it will be filtered</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRPr="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Filter into a new conical tube using a syringe with a cotton ball in it</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRPr="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Filtered liquid is clear</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:t xml:space="preserve">Add 2.5 times the volume of the liquid of cold pure ethanol (~10 mL </w:t></w:r><w:r><w:sym w:font="Wingdings" w:char="F0E0"/></w:r><w:r><w:t xml:space="preserve"> ~35 mL total volume</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRPr="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:t>Put in -20</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> for 20 minutes</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRPr="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Put in at ~4:00 pm</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRPr="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Taken out at ~4:22 pm</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRPr="008B4E10" w:rsidRDefault="008B4E10" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Centrifuge for 25 minutes at 4</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> at 4700 rpm, then check for a pellet</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008B4E10" w:rsidRPr="00F40981" w:rsidRDefault="00F40981" w:rsidP="008B4E10"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Pour off supernatant</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00F40981" w:rsidRPr="00F40981" w:rsidRDefault="00F40981" w:rsidP="00F40981"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Can tap the top of the tube against a paper towel to remove more ethanol</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00F40981" w:rsidRPr="00F40981" w:rsidRDefault="00F40981" w:rsidP="00F40981"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add at least 20 mL of 70% </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>EtOH</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> and shake to break up the pellet, then </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>fortex</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/></w:p><w:p w:rsidR="00F40981" w:rsidRPr="00F40981" w:rsidRDefault="00F40981" w:rsidP="00F40981"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Centrifuge at 3000 rpm for 7 minutes at 4</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00F40981" w:rsidRPr="00F40981" w:rsidRDefault="00F40981" w:rsidP="00F40981"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Pour off the supernatant</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00F40981" w:rsidRPr="00F40981" w:rsidRDefault="00F40981" w:rsidP="00F40981"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Resuspend</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> in 500 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of TE </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>RNAse</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> A (20 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>g</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>/mL)</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00F40981" w:rsidRPr="00F40981" w:rsidRDefault="00F40981" w:rsidP="00F40981"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 5 times that volume (2.5 mL) of BNL buffer (from old </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>miniprep</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> kit) and pipette in and out to mix</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00F40981" w:rsidRPr="00F40981" w:rsidRDefault="00F40981" w:rsidP="00F40981"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 750 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of the solution to a spin mini column and collection tube</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00F40981" w:rsidRPr="00F40981" w:rsidRDefault="00F40981" w:rsidP="00F40981"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Balance centrifuge and spin for 1 minute at 12500 rpm; discard flow-through</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00F40981" w:rsidRPr="00F40981" w:rsidRDefault="00F40981" w:rsidP="00F40981"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:t xml:space="preserve">Repeat with additional 750 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> until all of the solution has run through the column (centrifuge each time on the same settings and in the same column)</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00F40981" w:rsidRPr="00F40981" w:rsidRDefault="00F40981" w:rsidP="00F40981"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Spin down for 2 minutes at 12500 rpm to get rid of the rest of ethanol</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00F40981" w:rsidRPr="00F40981" w:rsidRDefault="00F40981" w:rsidP="00F40981"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Optional step that was not performed: can put in 50</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> room for a few minutes to evaporate the rest of the ethanol</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00F40981" w:rsidRPr="003F6466" w:rsidRDefault="00F40981" w:rsidP="00F40981"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 750 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidR="003F6466"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of wash buffer; spin and discard the flow-through</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="003F6466" w:rsidRPr="003F6466" w:rsidRDefault="003F6466" w:rsidP="00F40981"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Repeat with additional 750 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of wash buffer</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="003F6466" w:rsidRPr="003F6466" w:rsidRDefault="003F6466" w:rsidP="00F40981"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:lastRenderedPageBreak/><w:t xml:space="preserve">Place column into a new Eppendorf tube and place 40 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> off eluent (in this case, water) directly onto the bottom of the column without touching it with the pipette tip</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="003F6466" w:rsidRPr="003F6466" w:rsidRDefault="003F6466" w:rsidP="00F40981"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Wait ~3 minutes</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="003F6466" w:rsidRPr="003F6466" w:rsidRDefault="003F6466" w:rsidP="00F40981"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Centrifuge at 13000 rpm for 2 minutes and label flow-through vial</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="003F6466" w:rsidRDefault="003F6466" w:rsidP="00F40981"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="7"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Take measurement on </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>nanodrop</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> and label the vial with the concentration</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00584403" w:rsidRDefault="00584403"><w:r><w:t xml:space="preserve">Use </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:t>SnapGene</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:t xml:space="preserve"> to design primers for the 14 sequences to be overexpressed:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00584403" w:rsidRDefault="00584403" w:rsidP="00584403"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="5"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:t xml:space="preserve">Check for </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:t>EcoRI</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:t xml:space="preserve"> and </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:t>XhoI</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:t xml:space="preserve"> restriction sit</w:t></w:r><w:r w:rsidR="009E4B30"><w:t>es within each of the sequences</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00442ACC" w:rsidRDefault="009E4B30" w:rsidP="00442ACC"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="5"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:t>Check for directionality on the plasmid: direct or complementary</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="009E4B30" w:rsidRDefault="009E4B30" w:rsidP="00584403"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="5"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:t>If a restriction enzyme does not have sites within the sequence, add a site for that restriction enzyme to the appropriate primer and add 6 adenines beyond the site on the primer so that the restriction enzyme will work properly</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="009E4B30" w:rsidRDefault="009E4B30" w:rsidP="00584403"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="5"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:t>If the restriction enzyme does have a site within the sequence, end the primer at the end of the sequence to be amplified to leave the ends blunt</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="009E4B30" w:rsidRDefault="009E4B30" w:rsidP="00584403"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="5"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:t xml:space="preserve">If direct, add </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:t>EcoRI</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:t xml:space="preserve"> to the 5’ end and </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:t>XhoI</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:t xml:space="preserve"> to the 3’ end as appropriate</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="009E4B30" w:rsidRDefault="009E4B30" w:rsidP="00584403"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="5"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:t xml:space="preserve">If complementary, add </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:t>XhoI</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:t xml:space="preserve"> to the 5’ end and </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:t>EcoRI</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:t xml:space="preserve"> to the 3’ end as appropriate</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="009E4B30" w:rsidRPr="009E4B30" w:rsidRDefault="009E4B30" w:rsidP="0061465A"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="5"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:t>Maintain a T</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="009E4B30"><w:rPr><w:vertAlign w:val="subscript"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">m </w:t></w:r><w:r><w:t>for each primer above 60</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="009E4B30"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">C and approximately match the </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="009E4B30"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>T</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="009E4B30"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/><w:vertAlign w:val="subscript"/></w:rPr><w:t>m</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of paired primers</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="009E4B30" w:rsidRDefault="009E4B30" w:rsidP="009E4B30"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="5"/></w:numPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="009E4B30"><w:t>Ensure that</w:t></w:r><w:r><w:t xml:space="preserve"> there is only 1 binding site on the plasmid for each primer</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00584403" w:rsidRDefault="00584403"><w:r><w:t>6/5/15</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="009E4B30" w:rsidRDefault="00584403"><w:r><w:t>Continue designing primers as on 6/4 and check for c</w:t></w:r><w:r w:rsidR="009E4B30"><w:t xml:space="preserve">orrect amplification and for suggested annealing temperatures on </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidR="009E4B30"><w:t>amplifX</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidR="009E4B30"><w:t>:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="009E4B30" w:rsidRDefault="009E4B30" w:rsidP="009E4B30"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="6"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:t xml:space="preserve">Add the primers designed in </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:t>SnapGene</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:t xml:space="preserve"> to the primers list of </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:t>AmplifX</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/></w:p><w:p w:rsidR="009E4B30" w:rsidRDefault="009E4B30" w:rsidP="009E4B30"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="6"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:t xml:space="preserve">Add the full sequence of the plasmid to the sequence portion of </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:t>AmplifX</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/></w:p><w:p w:rsidR="009E4B30" w:rsidRDefault="009E4B30" w:rsidP="009E4B30"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="6"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:t>Select the primers in pairs as they should be used and select the full sequence; then click “PCR” &gt; “Run PCR”</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="009E4B30" w:rsidRDefault="009E4B30" w:rsidP="009E4B30"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="6"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:t>Click on the amplicon in the window at the bottom to display information on it, then see the “</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:t>Infos</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:t>” tab for details</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="009E4B30" w:rsidRDefault="009E4B30" w:rsidP="009E4B30"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="6"/></w:numPr></w:pPr><w:r><w:t>Check for expected annealing of primers, correct amplicon (length and portion of plasmid), and take note of information especially suggested annealing temperature</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00584403" w:rsidRDefault="009E4B30"><w:r><w:t>Order primers</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00966909" w:rsidRDefault="00966909"/><w:p w:rsidR="00966909" w:rsidRDefault="00966909"><w:r><w:t>6/8/15</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00966909" w:rsidRDefault="00966909"><w:r><w:t>Waiting for primers—no wet lab work</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00966909" w:rsidRDefault="00966909"/><w:p w:rsidR="00966909" w:rsidRDefault="00966909"><w:r><w:t>6/9/15</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00966909"><w:r><w:t xml:space="preserve">Group the 14 amplicons to be overexpressed by size so that similarly sized fragments can be run through PCR together </w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0061465A" w:rsidRDefault="0061465A"><w:r><w:lastRenderedPageBreak/><w:t>Primers arrive</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0061465A" w:rsidRDefault="0061465A"><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:t>Resuspend</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:t xml:space="preserve"> the dry primers in </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:t>Tris</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:t>-EDTA (TE) solution:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0061465A" w:rsidRDefault="0061465A" w:rsidP="0061465A"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="8"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:t xml:space="preserve">Add TE in </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> 10 times the number of </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>nmoles</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of primer that there are in each vial</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>—just add the solution; do not pipette in and out</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0061465A" w:rsidRDefault="0061465A" w:rsidP="0061465A"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="8"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Place the vials in the thermomixer at 65</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> for ~10 minutes</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0061465A" w:rsidRDefault="0061465A" w:rsidP="0061465A"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Make a 10x dilution of the concentrated primer solution:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0061465A" w:rsidRDefault="0061465A" w:rsidP="0061465A"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>To labeled vials, add:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0061465A" w:rsidRDefault="0061465A" w:rsidP="0061465A"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">90 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of H</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/><w:vertAlign w:val="subscript"/></w:rPr><w:t>2</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">0 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>MQft</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/></w:p><w:p w:rsidR="0061465A" w:rsidRDefault="0061465A" w:rsidP="0061465A"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">10 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of primer solution</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00F27A67"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Picked one of the groupings of amplicons made earlier to run PCR at the same settings: today, doing </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>hesA</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">, </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>nifB</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">, and </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>nifV</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">. Run 100 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> PCR tubes</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00F27A67"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Calculate volumes of solutions to add for 100 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> tube, then make 320 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of solution, without adding primers or polymerase, then complete the PCR solutions in </w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00297AE5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">100 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> recipe:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00297AE5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">29.9 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> water</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00297AE5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">20 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Phusion</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> buffer </w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00297AE5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">16 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>dNTP</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> solution</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00297AE5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">2 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> forward primer</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00297AE5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">2 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> reverse primer</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00297AE5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">2 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> 22.74 ng/</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> PSL2397 (plasmid as DNA template)</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00297AE5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">7.5 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> DMSO </w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00297AE5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">20 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>betaine</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00297AE5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">.6 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Phusion</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> polymerase</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00297AE5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Make </w:t></w:r><w:r w:rsidR="0009013C"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">PCR master mix for </w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">320 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidR="0009013C" w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidR="0009013C" w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidR="0009013C"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>of solution without primers or polymerase, adding:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00297AE5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">95.68 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> water</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00297AE5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">64 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> buffer</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00297AE5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">51.2 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>dNTP</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> solution</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00297AE5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">6.4 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> template DNA</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00297AE5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">24 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> DMSO</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00297AE5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">64 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>betaine</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00297AE5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 95.4 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of that solution to each </w:t></w:r><w:r w:rsidR="00A050D2"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>of 3 labeled PCR tubes, then add the following to complete the reaction mixtures</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00297AE5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">2 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r w:rsidR="002E63A8"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">of 10x diluted </w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>appropriate forward primer</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00297AE5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">2 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidR="002E63A8"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of 10x diluted</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> appropriate reverse primer</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00297AE5" w:rsidRDefault="00297AE5" w:rsidP="00297AE5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">.6 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> polymerase</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0061465A" w:rsidRDefault="00A050D2" w:rsidP="00297AE5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Run the 3 PCR tubes under the following conditions:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00A050D2" w:rsidRDefault="00A050D2" w:rsidP="00A050D2"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>98</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> for 2 minutes initially</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00A050D2" w:rsidRDefault="00A050D2" w:rsidP="00A050D2"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Cycle the following 35 times:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00A050D2" w:rsidRDefault="00A050D2" w:rsidP="00A050D2"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="2"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>98</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> for 25 seconds</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00A050D2" w:rsidRDefault="00A050D2" w:rsidP="00A050D2"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="2"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>56</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> for 35 seconds</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00A050D2" w:rsidRDefault="00A050D2" w:rsidP="00A050D2"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="2"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:lastRenderedPageBreak/><w:t>72</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> for 45 seconds</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00A050D2" w:rsidRDefault="00A050D2" w:rsidP="00A050D2"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Hold at 10</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00A050D2" w:rsidRDefault="00A050D2" w:rsidP="00A050D2"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Prepare a gel:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00A050D2" w:rsidRDefault="00A050D2" w:rsidP="00A050D2"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="10"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add ~50 mL of 1% agarose (in </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>tris</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> acetic acid EDTA or TAE buffer) to a flask in the ethidium bromide (</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>EtBr</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>) area of the lab</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00A050D2" w:rsidRDefault="00A050D2" w:rsidP="00A050D2"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="10"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 4 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>EtBr</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> to the flask and swirl to mix</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00A050D2" w:rsidRDefault="00A050D2" w:rsidP="00A050D2"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="10"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Pour the mixture into the gel plate, with a plastic piece inserted to form 3 large wells and a small one on the side </w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00A050D2" w:rsidRDefault="00A050D2" w:rsidP="00A050D2"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="10"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Try to remove bubbles—can chase them out with a pipette tip</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00A050D2" w:rsidRDefault="00A050D2" w:rsidP="00A050D2"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="10"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Allow the gel to set</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00A050D2" w:rsidRDefault="00A050D2" w:rsidP="00A050D2"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="10"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Pour additional TAE buffer into the plate as necessary </w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00A050D2" w:rsidRDefault="00A050D2" w:rsidP="00A050D2"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="10"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Pipette in and out of wells to clear them of any agarose—want clean wells in the gel</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00A050D2" w:rsidRDefault="00A050D2" w:rsidP="00A050D2"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Take samples out of PCR </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>thermocycler</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> and run them in the gel:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00A050D2" w:rsidRDefault="00A050D2" w:rsidP="00A050D2"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="11"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 15 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of 10x DNA loading dye to each and pipette in and out to mix to homogeneity</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00A050D2" w:rsidRDefault="00A050D2" w:rsidP="00A050D2"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="11"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Add each mixture to one of the wells in the gel</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00A050D2" w:rsidRDefault="00A050D2" w:rsidP="00A050D2"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="11"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Add 1 kb ladder to the small well</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00A050D2" w:rsidRDefault="00A050D2" w:rsidP="00A050D2"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="11"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Run the gel at ~82 V for ~20 minutes until 2 different shades of blue bands appear</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00A050D2" w:rsidRDefault="00A050D2" w:rsidP="00A050D2"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="11"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Run the gel at ~120 V for an additional ~20 minutes </w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0009013C" w:rsidRDefault="0009013C" w:rsidP="0009013C"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr></w:p><w:p w:rsidR="0009013C" w:rsidRDefault="0009013C" w:rsidP="0009013C"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>6/10/15</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0009013C" w:rsidRPr="0009013C" w:rsidRDefault="0009013C" w:rsidP="0009013C"><w:pPr><w:tabs><w:tab w:val="left" w:pos="4020"/></w:tabs><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Run PCR for the remaining amplicons</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:tab/></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0009013C" w:rsidRDefault="0009013C" w:rsidP="0009013C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Make PCR master mix for 1200 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of solution without primers or polymerase, adding:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0009013C" w:rsidRDefault="0009013C" w:rsidP="0009013C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">358.8 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> water (add 359 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> with a P1000)</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0009013C" w:rsidRDefault="0009013C" w:rsidP="0009013C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">240 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> buffer</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0009013C" w:rsidRDefault="0009013C" w:rsidP="0009013C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">192 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>dNTP</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> solution</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0009013C" w:rsidRDefault="0009013C" w:rsidP="0009013C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">24 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> 22.74 ng/</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> PSL2397 (plasmid as DNA template)</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0009013C" w:rsidRDefault="0009013C" w:rsidP="0009013C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">90 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> DMSO</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0009013C" w:rsidRDefault="0009013C" w:rsidP="0009013C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">240 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>betaine</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/></w:p><w:p w:rsidR="0009013C" w:rsidRDefault="0009013C" w:rsidP="0009013C"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 95.4 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of master mix to each of 11 labeled PCR tubes</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002E63A8" w:rsidRDefault="002E63A8" w:rsidP="002E63A8"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 95.4 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of that solution to each of 11 labeled PCR tubes, then add the following to complete the reaction mixtures:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002E63A8" w:rsidRDefault="002E63A8" w:rsidP="002E63A8"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">2 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of 10x diluted appropriate forward primer</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002E63A8" w:rsidRDefault="002E63A8" w:rsidP="002E63A8"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">2 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of 10x diluted appropriate reverse primer</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002C0313" w:rsidRDefault="002E63A8" w:rsidP="002C0313"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">.6 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> polymerase</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002C0313" w:rsidRDefault="002C0313" w:rsidP="002C0313"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Thermocycler</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> conditions for largest size group (</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>nifHDK</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> and </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>nifEN</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>):</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002C0313" w:rsidRDefault="002C0313" w:rsidP="002C0313"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>98</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> for 2 minutes initially</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002C0313" w:rsidRDefault="002C0313" w:rsidP="002C0313"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Cycle the following 35 times:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002C0313" w:rsidRDefault="002C0313" w:rsidP="002C0313"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="2"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>98</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> for 25 seconds</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002C0313" w:rsidRDefault="002C0313" w:rsidP="002C0313"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="2"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>56</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> for 35 seconds</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002C0313" w:rsidRDefault="002C0313" w:rsidP="002C0313"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="2"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:lastRenderedPageBreak/><w:t>72</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> for 2 minutes and 30 seconds</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002C0313" w:rsidRDefault="002C0313" w:rsidP="002C0313"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>72</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> for 10 minutes (final extension time)</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002C0313" w:rsidRDefault="002C0313" w:rsidP="002C0313"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Hold at 10°C</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002C0313" w:rsidRDefault="002C0313" w:rsidP="002C0313"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Thermocycler</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> conditions for smallest size group:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002C0313" w:rsidRDefault="002C0313" w:rsidP="002C0313"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>98</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> for 2 minutes initially</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002C0313" w:rsidRDefault="002C0313" w:rsidP="002C0313"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Cycle the following 35 times:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002C0313" w:rsidRDefault="002C0313" w:rsidP="002C0313"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="2"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>98</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C</w:t></w:r><w:r w:rsidR="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> for 20</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> seconds</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002C0313" w:rsidRDefault="0025153A" w:rsidP="002C0313"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="2"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>55</w:t></w:r><w:r w:rsidR="002C0313" w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> for 25</w:t></w:r><w:r w:rsidR="002C0313"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> seconds</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002C0313" w:rsidRDefault="002C0313" w:rsidP="002C0313"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="2"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>72</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> for </w:t></w:r><w:r w:rsidR="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>25 seconds</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002C0313" w:rsidRDefault="002C0313" w:rsidP="002C0313"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>72</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00584403"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>°C</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> for 10 minutes (final extension time)</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002C0313" w:rsidRDefault="002C0313" w:rsidP="002C0313"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="9"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Hold at 10°C</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0025153A" w:rsidRDefault="0025153A" w:rsidP="0025153A"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Prepare gels for PCR products with 1% agarose</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0025153A" w:rsidRDefault="0025153A" w:rsidP="0025153A"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Dilute concentrated DNA ladder (.5 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>g</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>/</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0061465A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> 1kb plus):</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0025153A" w:rsidRDefault="0025153A" w:rsidP="0025153A"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="13"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Combine:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0025153A" w:rsidRDefault="0025153A" w:rsidP="0025153A"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="13"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">40 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> DNA</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0025153A" w:rsidRDefault="0025153A" w:rsidP="0025153A"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="13"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">40 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> water</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="0025153A" w:rsidRDefault="0025153A" w:rsidP="0025153A"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="13"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">40 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> DNA loading dye </w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002C0313" w:rsidRDefault="0025153A" w:rsidP="002C0313"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="13"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Pipette in and out to mix</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 12 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of DNA loading dye to each 100 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> PCR reaction tube</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Run gels, cut out bands</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Purify the PCR product, using a kit:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="23"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Spin down the bands in vials</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="23"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Add BNL buffer to cover the gel</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="23"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Place on thermomixer at 65°C for about 10 minutes until the agarose is no longer solid</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="23"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Split into 2 tubes per PCR product</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="23"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 150 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of isopropanol and invert to mix</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="23"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Place one spin column in a collection tube for each DNA gel mixture</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="23"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 750 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of DNA mixture to the column and centrifuge at 13000 rpm for 1 minute; discard the flow-through and place back in same collection tube</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="23"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Repeat the previous step with addition DNA mix until all the mix has run through the column</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="23"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 700 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of washing buffer to the column and spin at 13000 rpm for 1 minute; discard the flow through and replace in collection tube</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="23"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Repeat previous step with additional 700 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of washing buffer</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="23"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Centrifuge for 2 minutes at 13,000 rpm </w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="23"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Place columns in thermomixer for ~3 minutes</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="23"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Place columns into a clean 1.5 mL </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>microcentrifuge</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> tube and apply 30 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of water to the center of the column to elute</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="23"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Incubate at room temperature for 1 minute</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="23"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Centrifuge for 1 minute at 13,000 rpm</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002C0313" w:rsidRPr="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002C0313"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="23"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Measure concentrations on </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>nanodrop</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> with 1.5 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of each sample</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002C0313" w:rsidRDefault="002C0313" w:rsidP="002C0313"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:lastRenderedPageBreak/><w:t>6/11/15</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008821A5" w:rsidRDefault="008821A5" w:rsidP="002C0313"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Perform a restriction enzyme digest of PCR products and of the plasmid backbone using 20 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> reactions:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008821A5" w:rsidRDefault="008821A5" w:rsidP="008821A5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="14"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Recipe specifications:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008821A5" w:rsidRDefault="008821A5" w:rsidP="008821A5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="14"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Use 2 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> 10x buffer with dye</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008821A5" w:rsidRDefault="008821A5" w:rsidP="008821A5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="14"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Enough volume of PCR product to provide 500 ng if possible (300 is enough if the concentration is too low)</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008821A5" w:rsidRDefault="008821A5" w:rsidP="008821A5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="14"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">1 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of each restriction enzyme (</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>XhoI</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> and </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>EcoRI</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> as appropriate)</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008821A5" w:rsidRDefault="008821A5" w:rsidP="008821A5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="14"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Water to reach 20 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> total volume</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008821A5" w:rsidRDefault="008821A5" w:rsidP="008821A5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="14"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Order of addition: water, buffer, DNA, enzyme</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008821A5" w:rsidRDefault="008821A5" w:rsidP="008821A5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="14"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Centrifuge for 1 minute; incubate at 37°C for ~3 hours</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008821A5" w:rsidRDefault="008821A5" w:rsidP="008821A5"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Redo PCR for the gene that did not have a band, using the same recipe and conditions as previously used</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008821A5" w:rsidRDefault="008821A5" w:rsidP="008821A5"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Prepare two gels:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008821A5" w:rsidRDefault="008821A5" w:rsidP="008821A5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="15"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>1 for restriction digest products with 1% agarose</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00D11EBC" w:rsidRDefault="00D11EBC" w:rsidP="00D11EBC"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="15"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add ladder and plasmid digest </w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00D11EBC" w:rsidRDefault="00D11EBC" w:rsidP="00D11EBC"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="2"/><w:numId w:val="15"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Can differentiate between digested and undigested (or linearized) plasmid, but other products have too small of a difference between digested and undigested to tell</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008821A5" w:rsidRDefault="008821A5" w:rsidP="008821A5"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="15"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>1 for PCR products of the small gene for which PCR is being redone</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00E50981" w:rsidRDefault="00E50981" w:rsidP="00E50981"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="15"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Make 2% agarose (helpful for smaller bands): </w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00E50981" w:rsidRDefault="00E50981" w:rsidP="00E50981"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="2"/><w:numId w:val="15"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Weigh 1 g agarose</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00E50981" w:rsidRDefault="00E50981" w:rsidP="00E50981"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="2"/><w:numId w:val="15"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Add 50 mL TAE buffer</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00E50981" w:rsidRDefault="00E50981" w:rsidP="00E50981"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="2"/><w:numId w:val="15"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Microwave until all agarose is dissolved </w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="008821A5" w:rsidRDefault="00D11EBC" w:rsidP="008821A5"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Purify the DNA fragments from the other digests (non-plasmid) using the small kit to elute at higher concentration:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00D11EBC" w:rsidRDefault="00D11EBC" w:rsidP="00D11EBC"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="16"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 100 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of DNA binding buffer to each sample</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00D11EBC" w:rsidRDefault="00D11EBC" w:rsidP="00D11EBC"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="16"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">20 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r w:rsidR="00DF04C9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">digest reaction x 5 (multiplier for DNA fragments, according to kit) = 10 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidR="00DF04C9" w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00DF04C9" w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidR="00DF04C9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> to add</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00DF04C9" w:rsidRDefault="00DF04C9" w:rsidP="00DF04C9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="16"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Pipette in and out to mix</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00DF04C9" w:rsidRDefault="00DF04C9" w:rsidP="00DF04C9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="16"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Transfer mixture to a spin column in a labeled collection tube</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00DF04C9" w:rsidRDefault="00DF04C9" w:rsidP="00DF04C9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="16"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Centrifuge for 30 seconds; discard the flow-through</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00DF04C9" w:rsidRDefault="00DF04C9" w:rsidP="00DF04C9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="16"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 200 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of DNA wash buffer to the column. Centrifuge for 30 seconds. Repeat the wash step</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00DF04C9" w:rsidRDefault="00DF04C9" w:rsidP="00DF04C9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="16"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 10 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> water to the column matrix and incubate at room temperature for ~2 minutes</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00DF04C9" w:rsidRDefault="00DF04C9" w:rsidP="00DF04C9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="16"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Transfer the column to a 1.5 mL </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>microcentrifuge</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> tube and centrifuge for 30 seconds to elute the DNA</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00DF04C9" w:rsidRDefault="00DF04C9" w:rsidP="00DF04C9"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Quantify the eluate with the </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>nanodrop</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> using 1 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of each sample </w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00511726" w:rsidRDefault="00511726" w:rsidP="00DF04C9"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Run gels for plasmid</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> digest</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> and PCR product </w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00511726" w:rsidRDefault="00511726" w:rsidP="00511726"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="17"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Plasmid:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00511726" w:rsidRDefault="00511726" w:rsidP="00511726"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="17"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>saw bands for fragment, backbone with fragment cut out, and linearized fragment (hoped to see only the first two)</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00511726" w:rsidRDefault="00511726" w:rsidP="00511726"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="17"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:lastRenderedPageBreak/><w:t>cut out only the band of the backbone with fragment cut out and purified</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00511726" w:rsidRDefault="00511726" w:rsidP="00511726"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="17"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">took concentration on </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>nanodrop</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/></w:p><w:p w:rsidR="00511726" w:rsidRDefault="00511726" w:rsidP="00511726"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="17"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>PCR product:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00511726" w:rsidRDefault="00511726" w:rsidP="00511726"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="17"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Cut and purified band</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00511726" w:rsidRDefault="00511726" w:rsidP="00511726"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="17"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Took concentration on </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>nanodrop</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00511726"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Purify the DNA fragments from non-plasmid digests using a kid for high concentration:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00216BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="19"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 100 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of DNA binding buffer to each sample</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00216BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="19"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">20 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> sample x 5 (multiplier for DNA fragments, according to kit) = 100 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00216BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="19"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Pipette </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>in and out to mix</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00216BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="19"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Transfer the mixture to a spin column in a labeled collection tube</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00216BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="19"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Centrifuge for 30 seconds; discard the flow-through</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00216BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="19"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 200 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of DNA wash buffer to the column. Centrifuge for 30 seconds</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00216BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="19"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Repeat </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>the wash step</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00216BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="19"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Ad</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>d</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> 10 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> water to the column matrix and incubate at room temperature for ~2 minutes</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00216BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="19"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Transfer the column to a 1.5 mL </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>microcentrifuge</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> tube and centrifuge for 30 seconds to elute the DNA</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00216BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="19"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Quantify concentrations with the </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>nanodrop</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">—1 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of each sample</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRPr="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00216BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="19"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Store at </w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>-20°C</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00672AFF" w:rsidRDefault="00511726" w:rsidP="00511726"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Set up 7 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="0025153A"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidR="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> ligation reactions for the</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00672AFF"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> digestion products that were digested by both enzymes:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00672AFF"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="18"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Recipe conditions:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00672AFF" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00216BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="18"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">.7 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> buffer</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00216BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="18"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">1 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> enzyme</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00216BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="18"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">.7 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> digested plasmid</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00216BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="18"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>5x more insert DNA than plasmid DNA</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00216BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="18"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Water to final volume</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00672AFF"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="18"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Order of addition: water, DNA, buffer, enzyme</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00672AFF"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="18"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Set up an additional ligation reaction for negative control: see if the plasmid will ligate to itself with no enzyme</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00672AFF"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="18"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Cyclic ligation conditions:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00216BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="18"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>37°C for 3 minutes</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00216BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="18"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>22°C for 3 minutes</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00216BC9"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Start an overnight culture</w:t></w:r><w:r w:rsidR="000D7D64"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> in 5 mL of LB at 37°C</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> for transformation of ligated plasmids</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="000D7D64" w:rsidRDefault="000D7D64" w:rsidP="00216BC9"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>6/12/15</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="000D7D64" w:rsidRDefault="000D7D64" w:rsidP="00216BC9"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Prepare competent cells using the </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>RbCl</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> method:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="000D7D64" w:rsidRDefault="000D7D64" w:rsidP="000D7D64"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="20"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Dilute 1 mL of culture into 50 mL of </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>LBMg</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> medium pre-warmed to 37°C</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="000D7D64" w:rsidRDefault="000D7D64" w:rsidP="000D7D64"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="20"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Grow at 37°C for approximately 2 hours on shaker to OD</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/><w:vertAlign w:val="subscript"/></w:rPr><w:t>600</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of about 0.6</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="000D7D64" w:rsidRDefault="000D7D64" w:rsidP="000D7D64"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="20"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Final OD</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/><w:vertAlign w:val="subscript"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">600 </w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="000D7D64"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>=</w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/><w:vertAlign w:val="subscript"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>0.598</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="000D7D64" w:rsidRDefault="000D7D64" w:rsidP="000D7D64"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="20"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Do not vortex cells after this point or allow them to warm above 4°C</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="000D7D64" w:rsidRDefault="000D7D64" w:rsidP="000D7D64"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="20"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Incubate for 20 minutes on ice</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="000D7D64" w:rsidRDefault="000D7D64" w:rsidP="000D7D64"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="20"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:lastRenderedPageBreak/><w:t>Transfer culture to an ice-cold 50 mL conical tube</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="000D7D64" w:rsidRDefault="000D7D64" w:rsidP="000D7D64"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="20"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Centrifuge for 15 minutes at 3000 rpm and 4°C; pour of the supernatant</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="000D7D64" w:rsidRDefault="000D7D64" w:rsidP="000D7D64"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="20"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Resuspend</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> in 20 mL of Tbf1 from 4°C fridge</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="000D7D64" w:rsidRDefault="000D7D64" w:rsidP="000D7D64"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="20"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Using pipette tips from the freezer, start with less than 20 mL and pipette in and out to </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>resuspend</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>, then add up to 20 mL volume</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="000D7D64" w:rsidRDefault="000D7D64" w:rsidP="000D7D64"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="20"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Incubate on ice for 25 minutes </w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="000D7D64" w:rsidRDefault="000D7D64" w:rsidP="000D7D64"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="20"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Centrifuge for 10 minutes at 3000 rpm and 4°C; remove the supernatant</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="000D7D64" w:rsidRDefault="000D7D64" w:rsidP="000D7D64"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="20"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Resuspend</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> in 4 mL of Tbf2 from the fridge</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="000D7D64" w:rsidRDefault="000D7D64" w:rsidP="000D7D64"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="20"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Aliquot 100 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> into </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>microcentrifuge</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> tubes</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="000D7D64" w:rsidRDefault="000D7D64" w:rsidP="000D7D64"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="20"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Work in the hood with cells on ice and place filled tubes into liquid nitrogen</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="000D7D64" w:rsidRDefault="000D7D64" w:rsidP="000D7D64"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Transform products from yesterday’s ligation reactions into the cells:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="000D7D64" w:rsidRDefault="000D7D64" w:rsidP="000D7D64"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="21"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Use PE5A plasmid (with ampicillin resistance) as an additional control</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="000D7D64" w:rsidRDefault="000D7D64" w:rsidP="000D7D64"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="21"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Original concentration of plasmid: 375 ng/</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/></w:p><w:p w:rsidR="000D7D64" w:rsidRDefault="000D7D64" w:rsidP="000D7D64"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="21"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Take 2 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of PE5A and 98 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> water</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00D2239B" w:rsidRDefault="00D2239B" w:rsidP="00D2239B"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="21"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Take 1 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of that mixture and add 99 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> water</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00D2239B" w:rsidRDefault="00D2239B" w:rsidP="00D2239B"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="21"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 1 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of that to a vial of competent cells</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00D2239B" w:rsidRDefault="00D2239B" w:rsidP="00D2239B"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="21"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add the ligation reaction products to other labeled vials of competent cells </w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00D2239B" w:rsidRDefault="00D2239B" w:rsidP="00D2239B"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="21"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Heat shock at 42°C for 1 minute; replace on ice for ~2 minutes</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00D2239B" w:rsidRDefault="00D2239B" w:rsidP="00D2239B"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="21"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add 900 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidR="00E23BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>of LB to each tube (working within the radius of flame)</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00D2239B" w:rsidRDefault="00D2239B" w:rsidP="00D2239B"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="21"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Place on shaker at 37°C for 1 hour</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00D2239B" w:rsidRDefault="00D2239B" w:rsidP="00D2239B"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Make plates:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00D2239B" w:rsidRDefault="00D2239B" w:rsidP="00D2239B"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="22"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Melt LB agar in the microwave; incubate on ice for 25 minutes</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00D2239B" w:rsidRDefault="00D2239B" w:rsidP="00D2239B"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="22"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Add appropriate antibiotic to LB agar</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00D2239B" w:rsidRDefault="00D2239B" w:rsidP="00D2239B"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="22"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Antibiotic is heat sensitive—wait until cooled on ice</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00D2239B" w:rsidRDefault="00D2239B" w:rsidP="00D2239B"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="22"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Antibiotic stocks in the lab are prepared such that 1 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> is needed per mL of agar</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00D2239B" w:rsidRDefault="00D2239B" w:rsidP="00D2239B"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="22"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Use chloramphenicol for the digests and negative control</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00D2239B" w:rsidRDefault="00D2239B" w:rsidP="00D2239B"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="22"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Use ampicillin for the PE5A plasmid</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00D2239B" w:rsidRDefault="00D2239B" w:rsidP="00D2239B"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="22"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Pour ~20 mL of LB agar with antibiotic per plate; pour slowly to avoid bubbles</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00D2239B" w:rsidRDefault="00D2239B" w:rsidP="00D2239B"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="22"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Place in hood with lids slightly off to avoid condensation</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00D2239B" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="00D2239B"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="22"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Label bottom of plates with antibiotic, gene, and date</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Plate cells:</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="24"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Take cells out of 37°C room</w:t></w:r><w:r w:rsidR="005C7891"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>and spin down all but the control for efficiency of transformation (PE5A) for 4 minutes</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="24"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Take 100 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> from PE5A control and add to 900 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of LB</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="24"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Plate 100 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of that dilution on the amp plate</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="24"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Add sterile glass beads and shake laterally to spread around the culture</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="002A7DB1" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="24"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Dump beads into nonsterile glass beads container</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="002A7DB1" w:rsidRDefault="005C7891" w:rsidP="002A7DB1"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="24"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">From centrifuged cultures, pipette off the media to the 100 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> mark and </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>resuspend</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> the pellet in that amount of media</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="005C7891" w:rsidRDefault="005C7891" w:rsidP="005C7891"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="24"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Add full </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>resuspended</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> quantity to the correct labeled plate</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="005C7891" w:rsidRDefault="005C7891" w:rsidP="005C7891"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="24"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:lastRenderedPageBreak/><w:t>Add beads and shake</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="005C7891" w:rsidRDefault="005C7891" w:rsidP="005C7891"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="24"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Place all plates in 37°C room</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="005C7891" w:rsidRDefault="005C7891" w:rsidP="005C7891"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>6/13/15</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="005C7891" w:rsidRDefault="005C7891" w:rsidP="005C7891"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Take plates out of 37°C room, check for colonies, and place those that grew into the 4°C room for the remainder of the weekend</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="005C7891" w:rsidRDefault="005C7891" w:rsidP="005C7891"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>6/15/15</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="005C7891" w:rsidRDefault="005C7891" w:rsidP="005C7891"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Start a culture of PA2C-TesA in LB for ~4 hours</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="005C7891" w:rsidRDefault="005C7891" w:rsidP="005C7891"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Redo PCR using same conditions as previously for the genes that were not successfully transformed</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="005C7891" w:rsidRDefault="005C7891" w:rsidP="005C7891"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Prepare a gel</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="005C7891" w:rsidRDefault="005C7891" w:rsidP="005C7891"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Run the PCR products on the gel and cut appropriate bands</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="005C7891" w:rsidRDefault="005C7891" w:rsidP="005C7891"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Purify the PCR product with a kit, as previously and take concentrations on </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>nanodrop</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/></w:p><w:p w:rsidR="005C7891" w:rsidRDefault="005C7891" w:rsidP="005C7891"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Purify the PA2C-TesA plasmid as previously and take concentration on </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>nanodrop</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/></w:p><w:p w:rsidR="00E23BC9" w:rsidRDefault="005C7891" w:rsidP="005C7891"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Set up 20 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> digest re</w:t></w:r><w:r w:rsidR="00E23BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">actions for the newly purified genes using the same specifications as previously </w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00E23BC9" w:rsidRDefault="00E23BC9" w:rsidP="00E23BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="25"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Place at 37°C for ~2 hours</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00E23BC9" w:rsidRDefault="00E23BC9" w:rsidP="00E23BC9"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Prepare a gel</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00E23BC9" w:rsidRPr="00E23BC9" w:rsidRDefault="00E23BC9" w:rsidP="00E23BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="25"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r w:rsidRPr="00E23BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>~50 mL 1% agarose and 4</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00E23BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00E23BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00E23BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r w:rsidRPr="00E23BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> of </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00E23BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>EtBr</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/></w:p><w:p w:rsidR="00E23BC9" w:rsidRDefault="00E23BC9" w:rsidP="00E23BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="25"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">Run digested plasmid through the gel </w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00E23BC9" w:rsidRDefault="00E23BC9" w:rsidP="00E23BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="25"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve">First well: undigested plasmid (2 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> 1:10 PA2C-TesA, 2 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> DNA loading dye 10x, and 16 </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> water)</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00E23BC9" w:rsidRDefault="00E23BC9" w:rsidP="00E23BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="25"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Second well: digested plasmid (3</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00E23BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> </w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellStart"/><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:bCs/><w:color w:val="000000"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>μ</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00216BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>L</w:t></w:r><w:proofErr w:type="spellEnd"/><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> 10x loading dye and digest product)</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00E23BC9" w:rsidRDefault="00E23BC9" w:rsidP="00E23BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="1"/><w:numId w:val="25"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Last well: 1 kb plus ladder</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00E23BC9" w:rsidRDefault="00E23BC9" w:rsidP="00E23BC9"><w:pPr><w:pStyle w:val="ListParagraph"/><w:numPr><w:ilvl w:val="0"/><w:numId w:val="25"/></w:numPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t>Saw no band for digested plasmid and a band in unexpected location for the undigested plasmid</w:t></w:r><w:r w:rsidRPr="00E23BC9"><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:sym w:font="Wingdings" w:char="F0E0"/></w:r><w:r><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr><w:t xml:space="preserve"> need to redo the digestion of the plasmid</w:t></w:r></w:p><w:p w:rsidR="00E23BC9" w:rsidRPr="00E23BC9" w:rsidRDefault="00E23BC9" w:rsidP="00E23BC9"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr></w:p><w:p w:rsidR="00216BC9" w:rsidRPr="00216BC9" w:rsidRDefault="00216BC9" w:rsidP="00216BC9"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr></w:p><w:p w:rsidR="002C0313" w:rsidRPr="002C0313" w:rsidRDefault="002C0313" w:rsidP="002C0313"><w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:cs="Arial"/><w:shd w:val="clear" w:color="auto" w:fill="FFFFFF"/></w:rPr></w:pPr></w:p><w:sectPr w:rsidR="002C0313" w:rsidRPr="002C0313"><w:pgSz w:w="12240" w:h="15840"/><w:pgMar w:top="1440" w:right="1440" w:bottom="1440" w:left="1440" w:header="720" w:footer="720" w:gutter="0"/><w:cols w:space="720"/><w:docGrid w:linePitch="360"/></w:sectPr></w:body></w:document></pkg:xmlData></pkg:part><pkg:part pkg:name="/word/theme/theme1.xml" pkg:contentType="application/vnd.openxmlformats-officedocument.theme+xml"><pkg:xmlData><a:theme name="Office Theme" xmlns:a="http://schemas.openxmlformats.org/drawingml/2006/main"><a:themeElements><a:clrScheme name="Office"><a:dk1><a:sysClr val="windowText" lastClr="000000"/></a:dk1><a:lt1><a:sysClr val="window" lastClr="FFFFFF"/></a:lt1><a:dk2><a:srgbClr val="44546A"/></a:dk2><a:lt2><a:srgbClr val="E7E6E6"/></a:lt2><a:accent1><a:srgbClr val="5B9BD5"/></a:accent1><a:accent2><a:srgbClr val="ED7D31"/></a:accent2><a:accent3><a:srgbClr val="A5A5A5"/></a:accent3><a:accent4><a:srgbClr val="FFC000"/></a:accent4><a:accent5><a:srgbClr val="4472C4"/></a:accent5><a:accent6><a:srgbClr val="70AD47"/></a:accent6><a:hlink><a:srgbClr val="0563C1"/></a:hlink><a:folHlink><a:srgbClr val="954F72"/></a:folHlink></a:clrScheme><a:fontScheme name="Office"><a:majorFont><a:latin typeface="Calibri Light" panose="020F0302020204030204"/><a:ea typeface=""/><a:cs typeface=""/><a:font script="Jpan" typeface="ＭＳ ゴシック"/><a:font script="Hang" typeface="맑은 고딕"/><a:font script="Hans" typeface="宋体"/><a:font script="Hant" typeface="新細明體"/><a:font script="Arab" typeface="Times New Roman"/><a:font script="Hebr" typeface="Times New Roman"/><a:font script="Thai" typeface="Angsana New"/><a:font script="Ethi" typeface="Nyala"/><a:font script="Beng" typeface="Vrinda"/><a:font script="Gujr" typeface="Shruti"/><a:font script="Khmr" typeface="MoolBoran"/><a:font script="Knda" typeface="Tunga"/><a:font script="Guru" typeface="Raavi"/><a:font script="Cans" typeface="Euphemia"/><a:font script="Cher" typeface="Plantagenet Cherokee"/><a:font script="Yiii" typeface="Microsoft Yi Baiti"/><a:font script="Tibt" typeface="Microsoft Himalaya"/><a:font script="Thaa" typeface="MV Boli"/><a:font script="Deva" typeface="Mangal"/><a:font script="Telu" typeface="Gautami"/><a:font script="Taml" typeface="Latha"/><a:font script="Syrc" typeface="Estrangelo Edessa"/><a:font script="Orya" typeface="Kalinga"/><a:font script="Mlym" typeface="Kartika"/><a:font script="Laoo" typeface="DokChampa"/><a:font script="Sinh" typeface="Iskoola Pota"/><a:font script="Mong" typeface="Mongolian Baiti"/><a:font script="Viet" typeface="Times New Roman"/><a:font script="Uigh" typeface="Microsoft Uighur"/><a:font script="Geor" typeface="Sylfaen"/></a:majorFont><a:minorFont><a:latin typeface="Calibri" panose="020F0502020204030204"/><a:ea typeface=""/><a:cs typeface=""/><a:font script="Jpan" typeface="ＭＳ 明朝"/><a:font script="Hang" typeface="맑은 고딕"/><a:font script="Hans" typeface="宋体"/><a:font script="Hant" typeface="新細明體"/><a:font script="Arab" typeface="Arial"/><a:font script="Hebr" typeface="Arial"/><a:font script="Thai" typeface="Cordia New"/><a:font script="Ethi" typeface="Nyala"/><a:font script="Beng" typeface="Vrinda"/><a:font script="Gujr" typeface="Shruti"/><a:font script="Khmr" typeface="DaunPenh"/><a:font script="Knda" typeface="Tunga"/><a:font script="Guru" typeface="Raavi"/><a:font script="Cans" typeface="Euphemia"/><a:font script="Cher" typeface="Plantagenet Cherokee"/><a:font script="Yiii" typeface="Microsoft Yi Baiti"/><a:font script="Tibt" typeface="Microsoft Himalaya"/><a:font script="Thaa" typeface="MV Boli"/><a:font script="Deva" typeface="Mangal"/><a:font script="Telu" typeface="Gautami"/><a:font script="Taml" typeface="Latha"/><a:font script="Syrc" typeface="Estrangelo Edessa"/><a:font script="Orya" typeface="Kalinga"/><a:font script="Mlym" typeface="Kartika"/><a:font script="Laoo" typeface="DokChampa"/><a:font script="Sinh" typeface="Iskoola Pota"/><a:font script="Mong" typeface="Mongolian Baiti"/><a:font script="Viet" typeface="Arial"/><a:font script="Uigh" typeface="Microsoft Uighur"/><a:font script="Geor" typeface="Sylfaen"/></a:minorFont></a:fontScheme><a:fmtScheme name="Office"><a:fillStyleLst><a:solidFill><a:schemeClr val="phClr"/></a:solidFill><a:gradFill rotWithShape="1"><a:gsLst><a:gs pos="0"><a:schemeClr val="phClr"><a:lumMod val="110000"/><a:satMod val="105000"/><a:tint val="67000"/></a:schemeClr></a:gs><a:gs pos="50000"><a:schemeClr val="phClr"><a:lumMod val="105000"/><a:satMod val="103000"/><a:tint val="73000"/></a:schemeClr></a:gs><a:gs pos="100000"><a:schemeClr val="phClr"><a:lumMod val="105000"/><a:satMod val="109000"/><a:tint val="81000"/></a:schemeClr></a:gs></a:gsLst><a:lin ang="5400000" scaled="0"/></a:gradFill><a:gradFill rotWithShape="1"><a:gsLst><a:gs pos="0"><a:schemeClr val="phClr"><a:satMod val="103000"/><a:lumMod val="102000"/><a:tint val="94000"/></a:schemeClr></a:gs><a:gs pos="50000"><a:schemeClr val="phClr"><a:satMod val="110000"/><a:lumMod val="100000"/><a:shade val="100000"/></a:schemeClr></a:gs><a:gs pos="100000"><a:schemeClr val="phClr"><a:lumMod val="99000"/><a:satMod val="120000"/><a:shade val="78000"/></a:schemeClr></a:gs></a:gsLst><a:lin ang="5400000" scaled="0"/></a:gradFill></a:fillStyleLst><a:lnStyleLst><a:ln w="6350" cap="flat" cmpd="sng" algn="ctr"><a:solidFill><a:schemeClr val="phClr"/></a:solidFill><a:prstDash val="solid"/><a:miter lim="800000"/></a:ln><a:ln w="12700" cap="flat" cmpd="sng" algn="ctr"><a:solidFill><a:schemeClr val="phClr"/></a:solidFill><a:prstDash val="solid"/><a:miter lim="800000"/></a:ln><a:ln w="19050" cap="flat" cmpd="sng" algn="ctr"><a:solidFill><a:schemeClr val="phClr"/></a:solidFill><a:prstDash val="solid"/><a:miter lim="800000"/></a:ln></a:lnStyleLst><a:effectStyleLst><a:effectStyle><a:effectLst/></a:effectStyle><a:effectStyle><a:effectLst/></a:effectStyle><a:effectStyle><a:effectLst><a:outerShdw blurRad="57150" dist="19050" dir="5400000" algn="ctr" rotWithShape="0"><a:srgbClr val="000000"><a:alpha val="63000"/></a:srgbClr></a:outerShdw></a:effectLst></a:effectStyle></a:effectStyleLst><a:bgFillStyleLst><a:solidFill><a:schemeClr val="phClr"/></a:solidFill><a:solidFill><a:schemeClr val="phClr"><a:tint val="95000"/><a:satMod val="170000"/></a:schemeClr></a:solidFill><a:gradFill rotWithShape="1"><a:gsLst><a:gs pos="0"><a:schemeClr val="phClr"><a:tint val="93000"/><a:satMod val="150000"/><a:shade val="98000"/><a:lumMod val="102000"/></a:schemeClr></a:gs><a:gs pos="50000"><a:schemeClr val="phClr"><a:tint val="98000"/><a:satMod val="130000"/><a:shade val="90000"/><a:lumMod val="103000"/></a:schemeClr></a:gs><a:gs pos="100000"><a:schemeClr val="phClr"><a:shade val="63000"/><a:satMod val="120000"/></a:schemeClr></a:gs></a:gsLst><a:lin ang="5400000" scaled="0"/></a:gradFill></a:bgFillStyleLst></a:fmtScheme></a:themeElements><a:objectDefaults/><a:extraClrSchemeLst/><a:extLst><a:ext uri="{05A4C25C-085E-4340-85A3-A5531E510DB2}"><thm15:themeFamily name="Office Theme" id="{62F939B6-93AF-4DB8-9C6B-D6C7DFDC589F}" vid="{4A3C46E8-61CC-4603-A589-7422A47A8E4A}" xmlns:thm15="http://schemas.microsoft.com/office/thememl/2012/main"/></a:ext></a:extLst></a:theme></pkg:xmlData></pkg:part><pkg:part pkg:name="/word/settings.xml" pkg:contentType="application/vnd.openxmlformats-officedocument.wordprocessingml.settings+xml"><pkg:xmlData><w:settings mc:Ignorable="w14 w15" xmlns:mc="http://schemas.openxmlformats.org/markup-compatibility/2006" xmlns:o="urn:schemas-microsoft-com:office:office" xmlns:r="http://schemas.openxmlformats.org/officeDocument/2006/relationships" xmlns:m="http://schemas.openxmlformats.org/officeDocument/2006/math" xmlns:v="urn:schemas-microsoft-com:vml" xmlns:w10="urn:schemas-microsoft-com:office:word" xmlns:w="http://schemas.openxmlformats.org/wordprocessingml/2006/main" xmlns:w14="http://schemas.microsoft.com/office/word/2010/wordml" xmlns:w15="http://schemas.microsoft.com/office/word/2012/wordml" xmlns:sl="http://schemas.openxmlformats.org/schemaLibrary/2006/main"><w:zoom w:percent="100"/><w:proofState w:spelling="clean" w:grammar="clean"/><w:defaultTabStop w:val="720"/><w:characterSpacingControl w:val="doNotCompress"/><w:compat><w:compatSetting w:name="compatibilityMode" w:uri="http://schemas.microsoft.com/office/word" w:val="15"/><w:compatSetting w:name="overrideTableStyleFontSizeAndJustification" w:uri="http://schemas.microsoft.com/office/word" w:val="1"/><w:compatSetting w:name="enableOpenTypeFeatures" w:uri="http://schemas.microsoft.com/office/word" w:val="1"/><w:compatSetting w:name="doNotFlipMirrorIndents" w:uri="http://schemas.microsoft.com/office/word" w:val="1"/><w:compatSetting w:name="differentiateMultirowTableHeaders" w:uri="http://schemas.microsoft.com/office/word" w:val="1"/></w:compat><w:rsids><w:rsidRoot w:val="002A750C"/><w:rsid w:val="0001694F"/><w:rsid w:val="00054359"/><w:rsid w:val="0009013C"/><w:rsid w:val="000D7D64"/><w:rsid w:val="000F350A"/><w:rsid w:val="00123772"/><w:rsid w:val="00216BC9"/><w:rsid w:val="0025153A"/><w:rsid w:val="00265A23"/><w:rsid w:val="00297AE5"/><w:rsid w:val="002A750C"/><w:rsid w:val="002A7DB1"/><w:rsid w:val="002C0313"/><w:rsid w:val="002E63A8"/><w:rsid w:val="003B19A8"/><w:rsid w:val="003F6466"/><w:rsid w:val="00442ACC"/><w:rsid w:val="00511726"/><w:rsid w:val="00517E90"/><w:rsid w:val="00584403"/><w:rsid w:val="005C7891"/><w:rsid w:val="0061465A"/><w:rsid w:val="00672AFF"/><w:rsid w:val="006E68E7"/><w:rsid w:val="00754E18"/><w:rsid w:val="007F561C"/><w:rsid w:val="008821A5"/><w:rsid w:val="008B4E10"/><w:rsid w:val="00925CB2"/><w:rsid w:val="00966909"/><w:rsid w:val="009E4B30"/><w:rsid w:val="00A050D2"/><w:rsid w:val="00A93DFB"/><w:rsid w:val="00D11EBC"/><w:rsid w:val="00D2239B"/><w:rsid w:val="00DF04C9"/><w:rsid w:val="00E23BC9"/><w:rsid w:val="00E50981"/><w:rsid w:val="00E73147"/><w:rsid w:val="00F27A67"/><w:rsid w:val="00F40981"/></w:rsids><m:mathPr><m:mathFont m:val="Cambria Math"/><m:brkBin m:val="before"/><m:brkBinSub m:val="--"/><m:smallFrac m:val="0"/><m:dispDef/><m:lMargin m:val="0"/><m:rMargin m:val="0"/><m:defJc m:val="centerGroup"/><m:wrapIndent m:val="1440"/><m:intLim m:val="subSup"/><m:naryLim m:val="undOvr"/></m:mathPr><w:themeFontLang w:val="en-US"/><w:clrSchemeMapping w:bg1="light1" w:t1="dark1" w:bg2="light2" w:t2="dark2" w:accent1="accent1" w:accent2="accent2" w:accent3="accent3" w:accent4="accent4" w:accent5="accent5" w:accent6="accent6" w:hyperlink="hyperlink" w:followedHyperlink="followedHyperlink"/><w:shapeDefaults><o:shapedefaults v:ext="edit" spidmax="1026"/><o:shapelayout v:ext="edit"><o:idmap v:ext="edit" data="1"/></o:shapelayout></w:shapeDefaults><w:decimalSymbol w:val="."/><w:listSeparator w:val=","/><w15:chartTrackingRefBased/><w15:docId w15:val="{7055EE32-FBC3-4B97-A95C-7992C0A878BE}"/></w:settings></pkg:xmlData></pkg:part><pkg:part pkg:name="/word/webSettings.xml" pkg:contentType="application/vnd.openxmlformats-officedocument.wordprocessingml.webSettings+xml"><pkg:xmlData><w:webSettings mc:Ignorable="w14 w15" xmlns:mc="http://schemas.openxmlformats.org/markup-compatibility/2006" xmlns:r="http://schemas.openxmlformats.org/officeDocument/2006/relationships" xmlns:w="http://schemas.openxmlformats.org/wordprocessingml/2006/main" xmlns:w14="http://schemas.microsoft.com/office/word/2010/wordml" xmlns:w15="http://schemas.microsoft.com/office/word/2012/wordml"><w:optimizeForBrowser/><w:relyOnVML/><w:allowPNG/></w:webSettings></pkg:xmlData></pkg:part><pkg:part pkg:name="/word/styles.xml" pkg:contentType="application/vnd.openxmlformats-officedocument.wordprocessingml.styles+xml"><pkg:xmlData><w:styles mc:Ignorable="w14 w15" xmlns:mc="http://schemas.openxmlformats.org/markup-compatibility/2006" xmlns:r="http://schemas.openxmlformats.org/officeDocument/2006/relationships" xmlns:w="http://schemas.openxmlformats.org/wordprocessingml/2006/main" xmlns:w14="http://schemas.microsoft.com/office/word/2010/wordml" xmlns:w15="http://schemas.microsoft.com/office/word/2012/wordml"><w:docDefaults><w:rPrDefault><w:rPr><w:rFonts w:asciiTheme="minorHAnsi" w:eastAsiaTheme="minorHAnsi" w:hAnsiTheme="minorHAnsi" w:cstheme="minorBidi"/><w:sz w:val="22"/><w:szCs w:val="22"/><w:lang w:val="en-US" w:eastAsia="en-US" w:bidi="ar-SA"/></w:rPr></w:rPrDefault><w:pPrDefault><w:pPr><w:spacing w:after="160" w:line="259" w:lineRule="auto"/></w:pPr></w:pPrDefault></w:docDefaults><w:latentStyles w:defLockedState="0" w:defUIPriority="99" w:defSemiHidden="0" w:defUnhideWhenUsed="0" w:defQFormat="0" w:count="371"><w:lsdException w:name="Normal" w:uiPriority="0" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="heading 1" w:uiPriority="9" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="heading 2" w:semiHidden="1" w:uiPriority="9" w:unhideWhenUsed="1" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="heading 3" w:semiHidden="1" w:uiPriority="9" w:unhideWhenUsed="1" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="heading 4" w:semiHidden="1" w:uiPriority="9" w:unhideWhenUsed="1" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="heading 5" w:semiHidden="1" w:uiPriority="9" w:unhideWhenUsed="1" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="heading 6" w:semiHidden="1" w:uiPriority="9" w:unhideWhenUsed="1" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="heading 7" w:semiHidden="1" w:uiPriority="9" w:unhideWhenUsed="1" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="heading 8" w:semiHidden="1" w:uiPriority="9" w:unhideWhenUsed="1" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="heading 9" w:semiHidden="1" w:uiPriority="9" w:unhideWhenUsed="1" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="index 1" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="index 2" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="index 3" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="index 4" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="index 5" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="index 6" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="index 7" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="index 8" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="index 9" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="toc 1" w:semiHidden="1" w:uiPriority="39" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="toc 2" w:semiHidden="1" w:uiPriority="39" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="toc 3" w:semiHidden="1" w:uiPriority="39" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="toc 4" w:semiHidden="1" w:uiPriority="39" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="toc 5" w:semiHidden="1" w:uiPriority="39" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="toc 6" w:semiHidden="1" w:uiPriority="39" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="toc 7" w:semiHidden="1" w:uiPriority="39" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="toc 8" w:semiHidden="1" w:uiPriority="39" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="toc 9" w:semiHidden="1" w:uiPriority="39" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Normal Indent" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="footnote text" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="annotation text" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="header" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="footer" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="index heading" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="caption" w:semiHidden="1" w:uiPriority="35" w:unhideWhenUsed="1" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="table of figures" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="envelope address" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="envelope return" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="footnote reference" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="annotation reference" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="line number" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="page number" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="endnote reference" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="endnote text" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="table of authorities" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="macro" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="toa heading" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="List" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="List Bullet" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="List Number" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="List 2" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="List 3" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="List 4" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="List 5" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="List Bullet 2" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="List Bullet 3" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="List Bullet 4" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="List Bullet 5" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="List Number 2" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="List Number 3" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="List Number 4" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="List Number 5" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Title" w:uiPriority="10" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="Closing" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Signature" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Default Paragraph Font" w:semiHidden="1" w:uiPriority="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Body Text" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Body Text Indent" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="List Continue" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="List Continue 2" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="List Continue 3" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="List Continue 4" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="List Continue 5" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Message Header" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Subtitle" w:uiPriority="11" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="Salutation" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Date" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Body Text First Indent" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Body Text First Indent 2" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Note Heading" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Body Text 2" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Body Text 3" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Body Text Indent 2" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Body Text Indent 3" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Block Text" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Hyperlink" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="FollowedHyperlink" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Strong" w:uiPriority="22" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="Emphasis" w:uiPriority="20" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="Document Map" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Plain Text" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="E-mail Signature" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="HTML Top of Form" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="HTML Bottom of Form" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Normal (Web)" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="HTML Acronym" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="HTML Address" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="HTML Cite" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="HTML Code" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="HTML Definition" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="HTML Keyboard" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="HTML Preformatted" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="HTML Sample" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="HTML Typewriter" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="HTML Variable" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Normal Table" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="annotation subject" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="No List" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Outline List 1" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Outline List 2" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Outline List 3" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Simple 1" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Simple 2" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Simple 3" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Classic 1" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Classic 2" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Classic 3" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Classic 4" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Colorful 1" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Colorful 2" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Colorful 3" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Columns 1" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Columns 2" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Columns 3" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Columns 4" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Columns 5" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Grid 1" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Grid 2" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Grid 3" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Grid 4" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Grid 5" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Grid 6" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Grid 7" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Grid 8" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table List 1" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table List 2" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table List 3" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table List 4" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table List 5" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table List 6" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table List 7" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table List 8" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table 3D effects 1" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table 3D effects 2" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table 3D effects 3" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Contemporary" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Elegant" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Professional" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Subtle 1" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Subtle 2" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Web 1" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Web 2" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Web 3" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Balloon Text" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Table Grid" w:uiPriority="59"/><w:lsdException w:name="Table Theme" w:semiHidden="1" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="Placeholder Text" w:semiHidden="1"/><w:lsdException w:name="No Spacing" w:uiPriority="1" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="Light Shading" w:uiPriority="60"/><w:lsdException w:name="Light List" w:uiPriority="61"/><w:lsdException w:name="Light Grid" w:uiPriority="62"/><w:lsdException w:name="Medium Shading 1" w:uiPriority="63"/><w:lsdException w:name="Medium Shading 2" w:uiPriority="64"/><w:lsdException w:name="Medium List 1" w:uiPriority="65"/><w:lsdException w:name="Medium List 2" w:uiPriority="66"/><w:lsdException w:name="Medium Grid 1" w:uiPriority="67"/><w:lsdException w:name="Medium Grid 2" w:uiPriority="68"/><w:lsdException w:name="Medium Grid 3" w:uiPriority="69"/><w:lsdException w:name="Dark List" w:uiPriority="70"/><w:lsdException w:name="Colorful Shading" w:uiPriority="71"/><w:lsdException w:name="Colorful List" w:uiPriority="72"/><w:lsdException w:name="Colorful Grid" w:uiPriority="73"/><w:lsdException w:name="Light Shading Accent 1" w:uiPriority="60"/><w:lsdException w:name="Light List Accent 1" w:uiPriority="61"/><w:lsdException w:name="Light Grid Accent 1" w:uiPriority="62"/><w:lsdException w:name="Medium Shading 1 Accent 1" w:uiPriority="63"/><w:lsdException w:name="Medium Shading 2 Accent 1" w:uiPriority="64"/><w:lsdException w:name="Medium List 1 Accent 1" w:uiPriority="65"/><w:lsdException w:name="Revision" w:semiHidden="1"/><w:lsdException w:name="List Paragraph" w:uiPriority="34" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="Quote" w:uiPriority="29" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="Intense Quote" w:uiPriority="30" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="Medium List 2 Accent 1" w:uiPriority="66"/><w:lsdException w:name="Medium Grid 1 Accent 1" w:uiPriority="67"/><w:lsdException w:name="Medium Grid 2 Accent 1" w:uiPriority="68"/><w:lsdException w:name="Medium Grid 3 Accent 1" w:uiPriority="69"/><w:lsdException w:name="Dark List Accent 1" w:uiPriority="70"/><w:lsdException w:name="Colorful Shading Accent 1" w:uiPriority="71"/><w:lsdException w:name="Colorful List Accent 1" w:uiPriority="72"/><w:lsdException w:name="Colorful Grid Accent 1" w:uiPriority="73"/><w:lsdException w:name="Light Shading Accent 2" w:uiPriority="60"/><w:lsdException w:name="Light List Accent 2" w:uiPriority="61"/><w:lsdException w:name="Light Grid Accent 2" w:uiPriority="62"/><w:lsdException w:name="Medium Shading 1 Accent 2" w:uiPriority="63"/><w:lsdException w:name="Medium Shading 2 Accent 2" w:uiPriority="64"/><w:lsdException w:name="Medium List 1 Accent 2" w:uiPriority="65"/><w:lsdException w:name="Medium List 2 Accent 2" w:uiPriority="66"/><w:lsdException w:name="Medium Grid 1 Accent 2" w:uiPriority="67"/><w:lsdException w:name="Medium Grid 2 Accent 2" w:uiPriority="68"/><w:lsdException w:name="Medium Grid 3 Accent 2" w:uiPriority="69"/><w:lsdException w:name="Dark List Accent 2" w:uiPriority="70"/><w:lsdException w:name="Colorful Shading Accent 2" w:uiPriority="71"/><w:lsdException w:name="Colorful List Accent 2" w:uiPriority="72"/><w:lsdException w:name="Colorful Grid Accent 2" w:uiPriority="73"/><w:lsdException w:name="Light Shading Accent 3" w:uiPriority="60"/><w:lsdException w:name="Light List Accent 3" w:uiPriority="61"/><w:lsdException w:name="Light Grid Accent 3" w:uiPriority="62"/><w:lsdException w:name="Medium Shading 1 Accent 3" w:uiPriority="63"/><w:lsdException w:name="Medium Shading 2 Accent 3" w:uiPriority="64"/><w:lsdException w:name="Medium List 1 Accent 3" w:uiPriority="65"/><w:lsdException w:name="Medium List 2 Accent 3" w:uiPriority="66"/><w:lsdException w:name="Medium Grid 1 Accent 3" w:uiPriority="67"/><w:lsdException w:name="Medium Grid 2 Accent 3" w:uiPriority="68"/><w:lsdException w:name="Medium Grid 3 Accent 3" w:uiPriority="69"/><w:lsdException w:name="Dark List Accent 3" w:uiPriority="70"/><w:lsdException w:name="Colorful Shading Accent 3" w:uiPriority="71"/><w:lsdException w:name="Colorful List Accent 3" w:uiPriority="72"/><w:lsdException w:name="Colorful Grid Accent 3" w:uiPriority="73"/><w:lsdException w:name="Light Shading Accent 4" w:uiPriority="60"/><w:lsdException w:name="Light List Accent 4" w:uiPriority="61"/><w:lsdException w:name="Light Grid Accent 4" w:uiPriority="62"/><w:lsdException w:name="Medium Shading 1 Accent 4" w:uiPriority="63"/><w:lsdException w:name="Medium Shading 2 Accent 4" w:uiPriority="64"/><w:lsdException w:name="Medium List 1 Accent 4" w:uiPriority="65"/><w:lsdException w:name="Medium List 2 Accent 4" w:uiPriority="66"/><w:lsdException w:name="Medium Grid 1 Accent 4" w:uiPriority="67"/><w:lsdException w:name="Medium Grid 2 Accent 4" w:uiPriority="68"/><w:lsdException w:name="Medium Grid 3 Accent 4" w:uiPriority="69"/><w:lsdException w:name="Dark List Accent 4" w:uiPriority="70"/><w:lsdException w:name="Colorful Shading Accent 4" w:uiPriority="71"/><w:lsdException w:name="Colorful List Accent 4" w:uiPriority="72"/><w:lsdException w:name="Colorful Grid Accent 4" w:uiPriority="73"/><w:lsdException w:name="Light Shading Accent 5" w:uiPriority="60"/><w:lsdException w:name="Light List Accent 5" w:uiPriority="61"/><w:lsdException w:name="Light Grid Accent 5" w:uiPriority="62"/><w:lsdException w:name="Medium Shading 1 Accent 5" w:uiPriority="63"/><w:lsdException w:name="Medium Shading 2 Accent 5" w:uiPriority="64"/><w:lsdException w:name="Medium List 1 Accent 5" w:uiPriority="65"/><w:lsdException w:name="Medium List 2 Accent 5" w:uiPriority="66"/><w:lsdException w:name="Medium Grid 1 Accent 5" w:uiPriority="67"/><w:lsdException w:name="Medium Grid 2 Accent 5" w:uiPriority="68"/><w:lsdException w:name="Medium Grid 3 Accent 5" w:uiPriority="69"/><w:lsdException w:name="Dark List Accent 5" w:uiPriority="70"/><w:lsdException w:name="Colorful Shading Accent 5" w:uiPriority="71"/><w:lsdException w:name="Colorful List Accent 5" w:uiPriority="72"/><w:lsdException w:name="Colorful Grid Accent 5" w:uiPriority="73"/><w:lsdException w:name="Light Shading Accent 6" w:uiPriority="60"/><w:lsdException w:name="Light List Accent 6" w:uiPriority="61"/><w:lsdException w:name="Light Grid Accent 6" w:uiPriority="62"/><w:lsdException w:name="Medium Shading 1 Accent 6" w:uiPriority="63"/><w:lsdException w:name="Medium Shading 2 Accent 6" w:uiPriority="64"/><w:lsdException w:name="Medium List 1 Accent 6" w:uiPriority="65"/><w:lsdException w:name="Medium List 2 Accent 6" w:uiPriority="66"/><w:lsdException w:name="Medium Grid 1 Accent 6" w:uiPriority="67"/><w:lsdException w:name="Medium Grid 2 Accent 6" w:uiPriority="68"/><w:lsdException w:name="Medium Grid 3 Accent 6" w:uiPriority="69"/><w:lsdException w:name="Dark List Accent 6" w:uiPriority="70"/><w:lsdException w:name="Colorful Shading Accent 6" w:uiPriority="71"/><w:lsdException w:name="Colorful List Accent 6" w:uiPriority="72"/><w:lsdException w:name="Colorful Grid Accent 6" w:uiPriority="73"/><w:lsdException w:name="Subtle Emphasis" w:uiPriority="19" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="Intense Emphasis" w:uiPriority="21" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="Subtle Reference" w:uiPriority="31" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="Intense Reference" w:uiPriority="32" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="Book Title" w:uiPriority="33" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="Bibliography" w:semiHidden="1" w:uiPriority="37" w:unhideWhenUsed="1"/><w:lsdException w:name="TOC Heading" w:semiHidden="1" w:uiPriority="39" w:unhideWhenUsed="1" w:qFormat="1"/><w:lsdException w:name="Plain Table 1" w:uiPriority="41"/><w:lsdException w:name="Plain Table 2" w:uiPriority="42"/><w:lsdException w:name="Plain Table 3" w:uiPriority="43"/><w:lsdException w:name="Plain Table 4" w:uiPriority="44"/><w:lsdException w:name="Plain Table 5" w:uiPriority="45"/><w:lsdException w:name="Grid Table Light" w:uiPriority="40"/><w:lsdException w:name="Grid Table 1 Light" w:uiPriority="46"/><w:lsdException w:name="Grid Table 2" w:uiPriority="47"/><w:lsdException w:name="Grid Table 3" w:uiPriority="48"/><w:lsdException w:name="Grid Table 4" w:uiPriority="49"/><w:lsdException w:name="Grid Table 5 Dark" w:uiPriority="50"/><w:lsdException w:name="Grid Table 6 Colorful" w:uiPriority="51"/><w:lsdException w:name="Grid Table 7 Colorful" w:uiPriority="52"/><w:lsdException w:name="Grid Table 1 Light Accent 1" w:uiPriority="46"/><w:lsdException w:name="Grid Table 2 Accent 1" w:uiPriority="47"/><w:lsdException w:name="Grid Table 3 Accent 1" w:uiPriority="48"/><w:lsdException w:name="Grid Table 4 Accent 1" w:uiPriority="49"/><w:lsdException w:name="Grid Table 5 Dark Accent 1" w:uiPriority="50"/><w:lsdException w:name="Grid Table 6 Colorful Accent 1" w:uiPriority="51"/><w:lsdException w:name="Grid Table 7 Colorful Accent 1" w:uiPriority="52"/><w:lsdException w:name="Grid Table 1 Light Accent 2" w:uiPriority="46"/><w:lsdException w:name="Grid Table 2 Accent 2" w:uiPriority="47"/><w:lsdException w:name="Grid Table 3 Accent 2" w:uiPriority="48"/><w:lsdException w:name="Grid Table 4 Accent 2" w:uiPriority="49"/><w:lsdException w:name="Grid Table 5 Dark Accent 2" w:uiPriority="50"/><w:lsdException w:name="Grid Table 6 Colorful Accent 2" w:uiPriority="51"/><w:lsdException w:name="Grid Table 7 Colorful Accent 2" w:uiPriority="52"/><w:lsdException w:name="Grid Table 1 Light Accent 3" w:uiPriority="46"/><w:lsdException w:name="Grid Table 2 Accent 3" w:uiPriority="47"/><w:lsdException w:name="Grid Table 3 Accent 3" w:uiPriority="48"/><w:lsdException w:name="Grid Table 4 Accent 3" w:uiPriority="49"/><w:lsdException w:name="Grid Table 5 Dark Accent 3" w:uiPriority="50"/><w:lsdException w:name="Grid Table 6 Colorful Accent 3" w:uiPriority="51"/><w:lsdException w:name="Grid Table 7 Colorful Accent 3" w:uiPriority="52"/><w:lsdException w:name="Grid Table 1 Light Accent 4" w:uiPriority="46"/><w:lsdException w:name="Grid Table 2 Accent 4" w:uiPriority="47"/><w:lsdException w:name="Grid Table 3 Accent 4" w:uiPriority="48"/><w:lsdException w:name="Grid Table 4 Accent 4" w:uiPriority="49"/><w:lsdException w:name="Grid Table 5 Dark Accent 4" w:uiPriority="50"/><w:lsdException w:name="Grid Table 6 Colorful Accent 4" w:uiPriority="51"/><w:lsdException w:name="Grid Table 7 Colorful Accent 4" w:uiPriority="52"/><w:lsdException w:name="Grid Table 1 Light Accent 5" w:uiPriority="46"/><w:lsdException w:name="Grid Table 2 Accent 5" w:uiPriority="47"/><w:lsdException w:name="Grid Table 3 Accent 5" w:uiPriority="48"/><w:lsdException w:name="Grid Table 4 Accent 5" w:uiPriority="49"/><w:lsdException w:name="Grid Table 5 Dark Accent 5" w:uiPriority="50"/><w:lsdException w:name="Grid Table 6 Colorful Accent 5" w:uiPriority="51"/><w:lsdException w:name="Grid Table 7 Colorful Accent 5" w:uiPriority="52"/><w:lsdException w:name="Grid Table 1 Light Accent 6" w:uiPriority="46"/><w:lsdException w:name="Grid Table 2 Accent 6" w:uiPriority="47"/><w:lsdException w:name="Grid Table 3 Accent 6" w:uiPriority="48"/><w:lsdException w:name="Grid Table 4 Accent 6" w:uiPriority="49"/><w:lsdException w:name="Grid Table 5 Dark Accent 6" w:uiPriority="50"/><w:lsdException w:name="Grid Table 6 Colorful Accent 6" w:uiPriority="51"/><w:lsdException w:name="Grid Table 7 Colorful Accent 6" w:uiPriority="52"/><w:lsdException w:name="List Table 1 Light" w:uiPriority="46"/><w:lsdException w:name="List Table 2" w:uiPriority="47"/><w:lsdException w:name="List Table 3" w:uiPriority="48"/><w:lsdException w:name="List Table 4" w:uiPriority="49"/><w:lsdException w:name="List Table 5 Dark" w:uiPriority="50"/><w:lsdException w:name="List Table 6 Colorful" w:uiPriority="51"/><w:lsdException w:name="List Table 7 Colorful" w:uiPriority="52"/><w:lsdException w:name="List Table 1 Light Accent 1" w:uiPriority="46"/><w:lsdException w:name="List Table 2 Accent 1" w:uiPriority="47"/><w:lsdException w:name="List Table 3 Accent 1" w:uiPriority="48"/><w:lsdException w:name="List Table 4 Accent 1" w:uiPriority="49"/><w:lsdException w:name="List Table 5 Dark Accent 1" w:uiPriority="50"/><w:lsdException w:name="List Table 6 Colorful Accent 1" w:uiPriority="51"/><w:lsdException w:name="List Table 7 Colorful Accent 1" w:uiPriority="52"/><w:lsdException w:name="List Table 1 Light Accent 2" w:uiPriority="46"/><w:lsdException w:name="List Table 2 Accent 2" w:uiPriority="47"/><w:lsdException w:name="List Table 3 Accent 2" w:uiPriority="48"/><w:lsdException w:name="List Table 4 Accent 2" w:uiPriority="49"/><w:lsdException w:name="List Table 5 Dark Accent 2" w:uiPriority="50"/><w:lsdException w:name="List Table 6 Colorful Accent 2" w:uiPriority="51"/><w:lsdException w:name="List Table 7 Colorful Accent 2" w:uiPriority="52"/><w:lsdException w:name="List Table 1 Light Accent 3" w:uiPriority="46"/><w:lsdException w:name="List Table 2 Accent 3" w:uiPriority="47"/><w:lsdException w:name="List Table 3 Accent 3" w:uiPriority="48"/><w:lsdException w:name="List Table 4 Accent 3" w:uiPriority="49"/><w:lsdException w:name="List Table 5 Dark Accent 3" w:uiPriority="50"/><w:lsdException w:name="List Table 6 Colorful Accent 3" w:uiPriority="51"/><w:lsdException w:name="List Table 7 Colorful Accent 3" w:uiPriority="52"/><w:lsdException w:name="List Table 1 Light Accent 4" w:uiPriority="46"/><w:lsdException w:name="List Table 2 Accent 4" w:uiPriority="47"/><w:lsdException w:name="List Table 3 Accent 4" w:uiPriority="48"/><w:lsdException w:name="List Table 4 Accent 4" w:uiPriority="49"/><w:lsdException w:name="List Table 5 Dark Accent 4" w:uiPriority="50"/><w:lsdException w:name="List Table 6 Colorful Accent 4" w:uiPriority="51"/><w:lsdException w:name="List Table 7 Colorful Accent 4" w:uiPriority="52"/><w:lsdException w:name="List Table 1 Light Accent 5" w:uiPriority="46"/><w:lsdException w:name="List Table 2 Accent 5" w:uiPriority="47"/><w:lsdException w:name="List Table 3 Accent 5" w:uiPriority="48"/><w:lsdException w:name="List Table 4 Accent 5" w:uiPriority="49"/><w:lsdException w:name="List Table 5 Dark Accent 5" w:uiPriority="50"/><w:lsdException w:name="List Table 6 Colorful Accent 5" w:uiPriority="51"/><w:lsdException w:name="List Table 7 Colorful Accent 5" w:uiPriority="52"/><w:lsdException w:name="List Table 1 Light Accent 6" w:uiPriority="46"/><w:lsdException w:name="List Table 2 Accent 6" w:uiPriority="47"/><w:lsdException w:name="List Table 3 Accent 6" w:uiPriority="48"/><w:lsdException w:name="List Table 4 Accent 6" w:uiPriority="49"/><w:lsdException w:name="List Table 5 Dark Accent 6" w:uiPriority="50"/><w:lsdException w:name="List Table 6 Colorful Accent 6" w:uiPriority="51"/><w:lsdException w:name="List Table 7 Colorful Accent 6" w:uiPriority="52"/></w:latentStyles><w:style w:type="paragraph" w:default="1" w:styleId="Normal"><w:name w:val="Normal"/><w:qFormat/></w:style><w:style w:type="character" w:default="1" w:styleId="DefaultParagraphFont"><w:name w:val="Default Paragraph Font"/><w:uiPriority w:val="1"/><w:semiHidden/><w:unhideWhenUsed/></w:style><w:style w:type="table" w:default="1" w:styleId="TableNormal"><w:name w:val="Normal Table"/><w:uiPriority w:val="99"/><w:semiHidden/><w:unhideWhenUsed/><w:tblPr><w:tblInd w:w="0" w:type="dxa"/><w:tblCellMar><w:top w:w="0" w:type="dxa"/><w:left w:w="108" w:type="dxa"/><w:bottom w:w="0" w:type="dxa"/><w:right w:w="108" w:type="dxa"/></w:tblCellMar></w:tblPr></w:style><w:style w:type="numbering" w:default="1" w:styleId="NoList"><w:name w:val="No List"/><w:uiPriority w:val="99"/><w:semiHidden/><w:unhideWhenUsed/></w:style><w:style w:type="paragraph" w:styleId="ListParagraph"><w:name w:val="List Paragraph"/><w:basedOn w:val="Normal"/><w:uiPriority w:val="34"/><w:qFormat/><w:rsid w:val="00754E18"/><w:pPr><w:ind w:left="720"/><w:contextualSpacing/></w:pPr></w:style><w:style w:type="table" w:styleId="TableGrid"><w:name w:val="Table Grid"/><w:basedOn w:val="TableNormal"/><w:uiPriority w:val="59"/><w:rsid w:val="00442ACC"/><w:pPr><w:spacing w:after="0" w:line="240" w:lineRule="auto"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:eastAsiaTheme="minorEastAsia"/><w:sz w:val="24"/><w:szCs w:val="24"/><w:lang w:eastAsia="es-ES"/></w:rPr><w:tblPr><w:tblBorders><w:top w:val="single" w:sz="4" w:space="0" w:color="auto"/><w:left w:val="single" w:sz="4" w:space="0" w:color="auto"/><w:bottom w:val="single" w:sz="4" w:space="0" w:color="auto"/><w:right w:val="single" w:sz="4" w:space="0" w:color="auto"/><w:insideH w:val="single" w:sz="4" w:space="0" w:color="auto"/><w:insideV w:val="single" w:sz="4" w:space="0" w:color="auto"/></w:tblBorders></w:tblPr></w:style></w:styles></pkg:xmlData></pkg:part><pkg:part pkg:name="/docProps/core.xml" pkg:contentType="application/vnd.openxmlformats-package.core-properties+xml" pkg:padding="256"><pkg:xmlData><cp:coreProperties xmlns:cp="http://schemas.openxmlformats.org/package/2006/metadata/core-properties" xmlns:dc="http://purl.org/dc/elements/1.1/" xmlns:dcterms="http://purl.org/dc/terms/" xmlns:dcmitype="http://purl.org/dc/dcmitype/" xmlns:xsi="http://www.w3.org/2001/XMLSchema-instance"><dc:title/><dc:subject/><dc:creator>Charlotte</dc:creator><cp:keywords/><dc:description/><cp:lastModifiedBy>David Ayeke</cp:lastModifiedBy><cp:revision>2</cp:revision><dcterms:created xsi:type="dcterms:W3CDTF">2015-06-20T21:13:00Z</dcterms:created><dcterms:modified xsi:type="dcterms:W3CDTF">2015-06-20T21:13:00Z</dcterms:modified></cp:coreProperties></pkg:xmlData></pkg:part><pkg:part pkg:name="/word/numbering.xml" pkg:contentType="application/vnd.openxmlformats-officedocument.wordprocessingml.numbering+xml"><pkg:xmlData><w:numbering mc:Ignorable="w14 w15 wp14" xmlns:wpc="http://schemas.microsoft.com/office/word/2010/wordprocessingCanvas" xmlns:mc="http://schemas.openxmlformats.org/markup-compatibility/2006" xmlns:o="urn:schemas-microsoft-com:office:office" xmlns:r="http://schemas.openxmlformats.org/officeDocument/2006/relationships" xmlns:m="http://schemas.openxmlformats.org/officeDocument/2006/math" xmlns:v="urn:schemas-microsoft-com:vml" xmlns:wp14="http://schemas.microsoft.com/office/word/2010/wordprocessingDrawing" xmlns:wp="http://schemas.openxmlformats.org/drawingml/2006/wordprocessingDrawing" xmlns:w10="urn:schemas-microsoft-com:office:word" xmlns:w="http://schemas.openxmlformats.org/wordprocessingml/2006/main" xmlns:w14="http://schemas.microsoft.com/office/word/2010/wordml" xmlns:w15="http://schemas.microsoft.com/office/word/2012/wordml" xmlns:wpg="http://schemas.microsoft.com/office/word/2010/wordprocessingGroup" xmlns:wpi="http://schemas.microsoft.com/office/word/2010/wordprocessingInk" xmlns:wne="http://schemas.microsoft.com/office/word/2006/wordml" xmlns:wps="http://schemas.microsoft.com/office/word/2010/wordprocessingShape"><w:abstractNum w:abstractNumId="0" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="0BD06E4C"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="740EACC6"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="1" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="11EB109B"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="837A5CF8"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="2" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="1A613D30"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="556CA6C2"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="360" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1080" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1800" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2520" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3240" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3960" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4680" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5400" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6120" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="3" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="285161C8"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="25267AD2"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="4" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="28881BE9"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="09CE9FCA"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="5" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="30597F83"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="11F2CF64"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="6" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="327A229C"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="ECD8A92E"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="7" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="3CBE0450"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="22B24BA2"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="8" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="3F2777FD"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="D7403CFC"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="9" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="445B1C18"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="08B43B7E"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="10" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="447F0AD8"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="8408923A"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="11" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="465A21E3"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="71625482"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="12" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="46BA0CEE"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="66D21700"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="13" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="498B191D"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="26E6C510"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="14" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="4A1D0802"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="D2B62178"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="15" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="504E7DF6"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="1AA829BA"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="16" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="51043C8E"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="CB9A5E74"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="17" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="5A9B45F1"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="EFA2DED6"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="18" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="66AB7D84"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="2E76F280"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="19" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="68E02998"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="DC82FA46"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="20" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="6D7912F4"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="793681DC"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="21" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="6FCD5A99"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="C330C42A"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="22" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="702F1634"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="0A581C72"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="23" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="7DF60AEB"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="0F8CC226"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:abstractNum w:abstractNumId="24" w15:restartNumberingAfterBreak="0"><w:nsid w:val="7E7D538C"/><w:multiLevelType w:val="hybridMultilevel"/><w:tmpl w:val="F6DC1736"/><w:lvl w:ilvl="0" w:tplc="04090001"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="720" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="1" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="1440" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="2" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2160" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="3" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="2880" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="4" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="3600" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="5" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="4320" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="6" w:tplc="04090001" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5040" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Symbol" w:hAnsi="Symbol" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="7" w:tplc="04090003" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val="o"/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="5760" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Courier New" w:hAnsi="Courier New" w:cs="Courier New" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl><w:lvl w:ilvl="8" w:tplc="04090005" w:tentative="1"><w:start w:val="1"/><w:numFmt w:val="bullet"/><w:lvlText w:val=""/><w:lvlJc w:val="left"/><w:pPr><w:ind w:left="6480" w:hanging="360"/></w:pPr><w:rPr><w:rFonts w:ascii="Wingdings" w:hAnsi="Wingdings" w:hint="default"/></w:rPr></w:lvl></w:abstractNum><w:num w:numId="1"><w:abstractNumId w:val="5"/></w:num><w:num w:numId="2"><w:abstractNumId w:val="3"/></w:num><w:num w:numId="3"><w:abstractNumId w:val="15"/></w:num><w:num w:numId="4"><w:abstractNumId w:val="12"/></w:num><w:num w:numId="5"><w:abstractNumId w:val="20"/></w:num><w:num w:numId="6"><w:abstractNumId w:val="10"/></w:num><w:num w:numId="7"><w:abstractNumId w:val="21"/></w:num><w:num w:numId="8"><w:abstractNumId w:val="24"/></w:num><w:num w:numId="9"><w:abstractNumId w:val="4"/></w:num><w:num w:numId="10"><w:abstractNumId w:val="18"/></w:num><w:num w:numId="11"><w:abstractNumId w:val="0"/></w:num><w:num w:numId="12"><w:abstractNumId w:val="2"/></w:num><w:num w:numId="13"><w:abstractNumId w:val="7"/></w:num><w:num w:numId="14"><w:abstractNumId w:val="13"/></w:num><w:num w:numId="15"><w:abstractNumId w:val="14"/></w:num><w:num w:numId="16"><w:abstractNumId w:val="22"/></w:num><w:num w:numId="17"><w:abstractNumId w:val="1"/></w:num><w:num w:numId="18"><w:abstractNumId w:val="6"/></w:num><w:num w:numId="19"><w:abstractNumId w:val="11"/></w:num><w:num w:numId="20"><w:abstractNumId w:val="9"/></w:num><w:num w:numId="21"><w:abstractNumId w:val="23"/></w:num><w:num w:numId="22"><w:abstractNumId w:val="16"/></w:num><w:num w:numId="23"><w:abstractNumId w:val="17"/></w:num><w:num w:numId="24"><w:abstractNumId w:val="19"/></w:num><w:num w:numId="25"><w:abstractNumId w:val="8"/></w:num></w:numbering></pkg:xmlData></pkg:part><pkg:part pkg:name="/word/fontTable.xml" pkg:contentType="application/vnd.openxmlformats-officedocument.wordprocessingml.fontTable+xml"><pkg:xmlData><w:fonts mc:Ignorable="w14 w15" xmlns:mc="http://schemas.openxmlformats.org/markup-compatibility/2006" xmlns:r="http://schemas.openxmlformats.org/officeDocument/2006/relationships" xmlns:w="http://schemas.openxmlformats.org/wordprocessingml/2006/main" xmlns:w14="http://schemas.microsoft.com/office/word/2010/wordml" xmlns:w15="http://schemas.microsoft.com/office/word/2012/wordml"><w:font w:name="Symbol"><w:panose1 w:val="05050102010706020507"/><w:charset w:val="02"/><w:family w:val="roman"/><w:pitch w:val="variable"/><w:sig w:usb0="00000000" w:usb1="10000000" w:usb2="00000000" w:usb3="00000000" w:csb0="80000000" w:csb1="00000000"/></w:font><w:font w:name="Times New Roman"><w:panose1 w:val="02020603050405020304"/><w:charset w:val="00"/><w:family w:val="roman"/><w:pitch w:val="variable"/><w:sig w:usb0="E0002EFF" w:usb1="C0007843" w:usb2="00000009" w:usb3="00000000" w:csb0="000001FF" w:csb1="00000000"/></w:font><w:font w:name="Courier New"><w:panose1 w:val="02070309020205020404"/><w:charset w:val="00"/><w:family w:val="modern"/><w:pitch w:val="fixed"/><w:sig w:usb0="E0002AFF" w:usb1="C0007843" w:usb2="00000009" w:usb3="00000000" w:csb0="000001FF" w:csb1="00000000"/></w:font><w:font w:name="Wingdings"><w:panose1 w:val="05000000000000000000"/><w:charset w:val="02"/><w:family w:val="auto"/><w:pitch w:val="variable"/><w:sig w:usb0="00000000" w:usb1="10000000" w:usb2="00000000" w:usb3="00000000" w:csb0="80000000" w:csb1="00000000"/></w:font><w:font w:name="Calibri"><w:panose1 w:val="020F0502020204030204"/><w:charset w:val="00"/><w:family w:val="swiss"/><w:pitch w:val="variable"/><w:sig w:usb0="E00002FF" w:usb1="4000ACFF" w:usb2="00000001" w:usb3="00000000" w:csb0="0000019F" w:csb1="00000000"/></w:font><w:font w:name="Arial"><w:panose1 w:val="020B0604020202020204"/><w:charset w:val="00"/><w:family w:val="swiss"/><w:pitch w:val="variable"/><w:sig w:usb0="E0002AFF" w:usb1="C0007843" w:usb2="00000009" w:usb3="00000000" w:csb0="000001FF" w:csb1="00000000"/></w:font><w:font w:name="Calibri Light"><w:panose1 w:val="020F0302020204030204"/><w:charset w:val="00"/><w:family w:val="swiss"/><w:pitch w:val="variable"/><w:sig w:usb0="A00002EF" w:usb1="4000207B" w:usb2="00000000" w:usb3="00000000" w:csb0="0000019F" w:csb1="00000000"/></w:font></w:fonts></pkg:xmlData></pkg:part><pkg:part pkg:name="/docProps/app.xml" pkg:contentType="application/vnd.openxmlformats-officedocument.extended-properties+xml" pkg:padding="256"><pkg:xmlData><Properties xmlns="http://schemas.openxmlformats.org/officeDocument/2006/extended-properties" xmlns:vt="http://schemas.openxmlformats.org/officeDocument/2006/docPropsVTypes"><Template>Normal.dotm</Template><TotalTime>0</TotalTime><Pages>11</Pages><Words>2961</Words><Characters>16881</Characters><Application>Microsoft Office Word</Application><DocSecurity>0</DocSecurity><Lines>140</Lines><Paragraphs>39</Paragraphs><ScaleCrop>false</ScaleCrop><HeadingPairs><vt:vector size="2" baseType="variant"><vt:variant><vt:lpstr>Title</vt:lpstr></vt:variant><vt:variant><vt:i4>1</vt:i4></vt:variant></vt:vector></HeadingPairs><TitlesOfParts><vt:vector size="1" baseType="lpstr"><vt:lpstr/></vt:vector></TitlesOfParts><Company/><LinksUpToDate>false</LinksUpToDate><CharactersWithSpaces>19803</CharactersWithSpaces><SharedDoc>false</SharedDoc><HyperlinksChanged>false</HyperlinksChanged><AppVersion>15.0000</AppVersion></Properties></pkg:xmlData></pkg:part></pkg:package>