[TOC]
DDBJへの登録には指定された形式のアノテーションファイルが必要です。GFF3-to-DDBJ はこのアノテーションファイルをFASTA と GFF3ファイルから作るプログラムです。FASTA 単体から最小限のアノテーションファイルを作ることも可能です。
同種のプログラムは、NCBI登録にはtable2asnやGAG、EMBL登録にはEMBLmyGFF3などがあります。
テストフォルダに入出力のファイルの例があるのでご覧ください。.annの拡張子付きがDDBJアノテーションファイルになります。同じファイル名のFASTAとGFF3から生成しています。
DDBJアノテーション出力には幾多の守るべきルールはあるものの、正解には曖昧さが伴います。そのため当ツールではRefSeqの出すGFF3とGenBank形式の対応をもって「正解」と定義しています。（ただし指針がDDBJと異なるばあいにはDDBJのほうを優先しています。）これに基づいて、RefSeqのGenBank形式をできるだけシンプルにDDBJアノテーション形式に変換した正解例を、当ツールで作られるDDBJアノテーション出力とを比べることで評価をしています。評価の詳細ページはこちら。
なお評価の副産物としてのGenBankからDDBJアノテーションの変換ツール genbank-to-ddbj を同梱しています。良い品質のGenBank形式があるときにはGFF3から作るよりも有用かもしれません。
評価の一環として、DDBJ公開のParserも利用しています。
# ddbjという名前でconda環境をつくってbiocondaからパッケージをインストール
conda create -n ddbj -c bioconda -c conda-forge gff3toddbj
# 環境ddbjをアクティベート
conda activate ddbj# ddbjという名前でconda環境をつくってpipコマンドをインストール
conda create -n ddbj pip
# 環境ddbjをアクティベート
conda activate ddbj
# samtoolsに含まれる実行ファイルbgzipが必要
conda install -c bioconda samtools
# pipからgff3toddbjをインストール
pip install gff3toddbj# ソースをzipでダウンロード
wget https://github.com/yamaton/gff3_to_ddbj/archive/refs/heads/main.zip
# zipを展開、リネーム
unzip main.zip && mv gff3toddbj-main gff3toddbj && cd gff3toddbj
# ddbjという名前でconda環境をつくる
conda create -n ddbj
# 環境ddbjをアクティベート
conda activate ddbj
# ddbjに依存パッケージ (bioconda, bcbio-gff, toml, setuptools) をインストール
conda install -c bioconda -c conda-forge biopython bcbio-gff toml pysam samtools pip build
# gff3-to-ddbj および付属ツールをインストール
python -m build && pip install -e ./まずはスクリプトを動かしてみます。
gff3-to-ddbj \
--gff3 myfile.gff3 \ # この行を削除すると source, assembly_gap のみになります
--fasta myfile.fa \ # <<必須>>
--metadata mymetadata.toml \ # この行を削除するとCOMMON項目無しのデフォルト値が入ります
--locus_tag_prefix MYOWNPREFIX \ # この行を削除すると LOCUSTAGPREFIX_ に設定されます
--transl_table 1 \ # この行を削除すると 1 に設定されます
--output myawesome_output.ann # この行を削除すると標準出力に--gff3 <FILE>には入力GFF3ファイルへのパスを指定--fasta <FILE>には入力FASTAファイルへのパスを指定--metadata <FILE>にはTOML形式のメタデータファイルを指定--locus_tag_prefix <STRING>には BioSampleの申請時に得られたものを指定--transl_table <INT>は The Genetic Codes から適切な数字を選ぶ--output <FILE>には出力ファイル（＝アノテーション）のパスを指定
表示形式を変えるほかに以下のようなことをしています。
-
FASTAファイルがgzipで圧縮されているばあいbgzip圧縮を作成
- FASTAのインデックス化とメモリ節約のため
myname_bgzip.fa.gzのように_bgzipの付いたファイルが作成されます- bgzipfファイルはgzipと互換性があるのでそのまま他での利用も可能です
-
Features / Qualifiersの変換テーブルに基づいたリネーム
- これが当プログラムのコア機能になります
- Sequence Ontology （略称SO）をベースに、実際例により拡張したものとなっています
- たとえば GFF3 の3列目("type")に現れる "transcript" は (SO:0000673)にて "INSDC_feature:misc_RNA" とあるため
misc_RNAfeature に置き換えられます。
-
assembly_gapの検索・追加 -
/transl_tableのCDSへの追加 -
メタデータファイル中の
source情報を各エントリに追加 -
GFF3が
Is_circular=trueを含むばあいTOPOLOGYを/circular付で追加して環状ゲノムであることを明示- このとき始点・終点をまたぐ featureのlocation処理も行う
-
同じ親をもつfeatureを
join記法で結合CDS,exon,mat_peptide,V_segment,C_region,D-loop,misc_featureに対して適用- 例外として
geneを直接の親に持つexonは結合しない
-
RNAの位置情報を、ぶら下がる結合されたexonの位置情報で置き換える
-
CDSに開始・終了コドンが無い場合マークアップ (
<,>) で位置の補正 -
CDS下の
/productが値をひとつだけ持つよう変更。値が無いときには "hypothetical protein" に。複数値の残りは/noteへ。-
- 一般名が複数ある場合でも, 複数の名称を記載しないで下さい。また, そのために不必要な区切り記号を使用しないで下さい。一般名の複数記載を希望される場合は, 代表的な名称を /product qualifier に記載し, その他の名称を /note qualifier に記載して下さい。
- 機能, 名称等が不明な蛋白質の場合は, hypothetical protein と記載することを推奨します。
-
-
genefeatureが/geneまたは/gene_synonymを持つ場合、同qualifiersを下層featuresに対しコピー。 -
/geneが値を複数持つときには、ひとつだけを/geneの値とする。残りを/gene_synonymの値に。 -
Qualifier値に重複があるとき冗長分を削除
-
アノテーション行の並び替え
- (開始位置、Feature Keyによる優先度、終了位置) をもってソートします
- 優先度はこちらで定義。
source,TOPOLOGYが先頭にくるようにしています。
-
DDBJのFeature-Qualifier一覧表に基づいた出力のフィルタリング
- 多くのGFF3に記載されている
genefeature はここで無くなります。注意。 - フィルタによって捨てられる項目は、実行時に標準エラー出力として以下のようにずらっと並びます。
WARNING: [Discarded] feature -------> gene <------- (count: 49911) WARNING: [Discarded] feature -------> cDNA_match <------- (count: 10692) WARNING: [Discarded] feature -------> match <------- (count: 101) WARNING: [Discarded] feature -------> sequence_conflict <------- (count: 81) WARNING: [Discarded] (Feature, Qualifier) = (source, db_xref) (count: 687) WARNING: [Discarded] (Feature, Qualifier) = (source, Name) (count: 687) WARNING: [Discarded] (Feature, Qualifier) = (source, gbkey) (count: 687) WARNING: [Discarded] (Feature, Qualifier) = (source, genome) (count: 685) WARNING: [Discarded] (Feature, Qualifier) = (mRNA, Parent) (count: 57304) WARNING: [Discarded] (Feature, Qualifier) = (mRNA, db_xref) (count: 114608)
- 多くのGFF3に記載されている
GFF3とFASTAに無い情報をアノテーションファイルに入れるためメタデータファイルを用意します。たとえば DDBJサイトのアノテーション例に対応するメタデータはTOML形式で以下のように書かれます。なお省略なしのサンプルはこちらになります。
[COMMON]
[COMMON.SUBMITTER]
ab_name = [
"Robertson,G.R.",
"Mishima,H."
]
contact = "Hanako Mishima"
email = "[email protected]"
## ... 中略 ...
[COMMON.COMMENT]
line = [
"Please visit our website URL",
"http://www.ddbj.nig.ac.jp/"
]
メタデータファイルには以下の情報を入れられます。なおファイルが空でもプログラムは一応動作します。
-
COMMONに入れる基本情報
SUBMITTER,REFERENCEといった Features
-
COMMONに入れるメタ表記
-
例
[COMMON.assembly_gap] estimated_length = "unknown" gap_type = "within scaffold" linkage_evidence = "paired-ends"
-
COMMONの下にFeatureを入れておくことで、DDBJでつくられる最終記載（＝フラットファイル）に一律にQualifiersが挿入される機能があるようです。たとえば以下のようにしておくと、gff3-to-ddbjの生成するアノテーションファイルにおいてCOMMONエントリの下に
assembly_gap以下の項目が追加されます。これは最終記載においてassembly_gap毎に同じQualifier値が挿入されることになります。
-
-
Featureごとに挿入するQualifier情報
-
例: COMMON記法とは
[COMMON.assembly_gap]→[assembly_gap]が違うだけです[assembly_gap] estimated_length = "unknown" gap_type = "within scaffold" linkage_evidence = "paired-ends"
- FeatureごとのQualifier値の挿入を gff3-to-ddbj がつくるアノテーションファイルに対して行います。現在のところ
[source]と[assembly_gap]にのみ対応しています。上記「COMMONに入れるメタ情報」と実質的に同じことですが、アノテーションファイルの時点でFeature毎に値が入る点が違います。使い方は[COMMON.assembly_gap]を[assembly_gap]に置き換えるだけになります。
- FeatureごとのQualifier値の挿入を gff3-to-ddbj がつくるアノテーションファイルに対して行います。現在のところ
-
gff3-to-ddbj 実行時にメタデータファイルが指定されない場合は、「とりあえず」として用意されたデフォルト設定がロードされます。
さらなる例としては、DDBJのサンプルアノテーションの WGS in COMMON と WGSに対応するメタデータファイル metadata_WGS_COMMON.toml と metadata_WGS.toml を用意しています。参考にしてください。
GFF3 と DDBJ アノテーションには大まかに以下のような対応があります。
- GFF3 の3列目 "type" → DDBJ アノテーション 2列目 Feature Key
- GFF3 の9列目 "attribute" → DDBJ アノテーション 4，5列目 Qualifier Key, Value
そしてDDBJアノテーションとして許されるFeaturesとQualifiersの名前には規定があります [Feature-Qualifier 一覧表]。
GFF3で使われる名前・値とINSDCやDDBJで定められた名前・値の橋渡しをするため、GFF3-to-DDBJはTOML形式の変換設定 を読み込んでリネームを行っています。デフォルトの変換設定はthe Sequence Ontology (SO)や類似ツールを参考に頑張って作ってありますが、まだまだ改善の余地があるでしょうし、またGFF3アノテーションのSequence Ontology準拠レベルにも依存すると思われます。
以下は、デフォルトの変換テーブルで不十分な場合のカスタマイズについてです。
GFF3 の type として現れるものがそのままFeature keyになってほしくないときには、このリネームを行います。
たとえばデフォルト設定では five_prime_UTR としてGFF3の3列目 ("type") に現れるものは、アノテーションファイルでは 5'UTR というFeature keyに置き換えられます。この変換はTOMLで以下のように書きます。
[five_prime_UTR]
feature_key = "5'UTR"Typeに関係なく指定のattributeについて一律リネームを行うばあいです。このケースでは値にprefixを付けることも可能です。たとえばデフォルト設定ではGFF3での ID=foobar というattributeはすべて /note qualifierとして /note=ID:foobar のように置き換えています。(なお Qualifier key を明示するとき /note のように /をつけて表記する慣習に従っています。ただしアノテーションではスラッシュを付けない規則のため TOMLファイル中にて /note のように書くことはありません。)
対応する設定はこちらです。__ANY__ という決め打ちのtype名の下にattributeを書きます。
[__ANY__.ID]
qualifier_key = "note"
qualifier_value_prefix = "ID:" # qualifier_value_prefixは省略可またqualifierキーと値の両方を設定するには以下のように書きます。たとえば /pseudo DDBJ新規登録において非推奨のため、 /pseudo=trueといった値に関係なく /pseudogene="unknown" で置き換える措置をデフォルトで行っています。
# /pseudo は常に /pseudogene="unknown" に置き換える
[__ANY__.pseudo]
qualifier_key = "pseudogene"
qualifier_value = "unknown"GFF3の特定typeについて、Qualifier key, valueの付いたFeatureで置き換えることもできます。たとえばデフォルト設定では snRNA というtypeを /ncRNA_class="snRNA" というqualifierを付けたFeature ncRNA に変換しています。
[snRNA]
feature_key = "ncRNA"
qualifier_key = "ncRNA_class"
qualifier_value = "snRNA"GFF3にてとある (type名, attributeキー, attribute value) があるとき、これを Feature key として表す必要に迫られることがあります。たとえばデフォルト設定では、GFF3の３列目が RNA かつ９列目が biotype="misc_RNA" であるとき misc_RNA Featureとして扱うよう変換をかけています。マッチさせたい単語をドット区切りで、featureキー、qualifierキー、qualifier値の順に書きます。
[RNA.biotype.misc_RNA]
feature_key = "misc_RNA"デフォルト設定 translate_features_qualifiers.toml を参考にカスタマイズしたファイルを用意してください。カスタマイズしたTOMLファイルを読み込ませるには
--config_rename <FILE>
のコマンドラインオプションを使います。これを利用した呼び出し例は以下のようになります。
gff3-to-ddbj \
--gff3 myfile.gff3 \
--fasta myfile.fa \
--metadata mymetadata.toml \
--locus_tag_prefix MYOWNPREFIX_ \
--transl_table 1 \
--config_rename my_translate_features_qualifiers.toml \ # リネーム変換用ファイルを指定
--output myawesome_output.annDDBJの登録にて推奨される(Feature, Qualifier)の組は限定されているため、アノテーションの出力にフィルタリングを行っています。 デフォルトではDDBJのFeature/Qualifier 対応一覧表に準じたTOML形式の設定を読みこみます。このファイルでは以下のような構造を取ります。
CDS = [
"EC_number",
"inference",
"locus_tag",
"note",
"product",
]
exon = [
"gene",
"locus_tag",
"note",
]出力として許される Features および Qualifiers を、左辺にFeature名、右辺にQualifier名を要素にもつリストを書くことで表しています。
たとえば上記の設定では、出力は CDS および exon のFeatures のみ、そして対応する Qualifiers は記述されたキーに限定されます。
この機能をカスタマイズするばあいには、TOMLファイルを編集したうえで
--config_filter <FILE>
のコマンドラインオプションを使ってファイルを入力してください。
アノテーションファイルへの変換を始めるまえに、手持ちのファイルがGFF3形式を満たしているかチェックをかけておくのが良いプラクティスです。オンラインで利用可能なものは GFF3 online validator が便利です。ファイル上限が 50MB なのが玉に瑕です。
GFF3 ファイル中に ##FASTA を使っての塩基配列が含まれている場合にはその旨のエラーが出ます。同梱のツールを使うなどして分割してください。
split-fasta path/to/myfile.gff3 --suffix "_splitted"このばあい myfile_splitted.gff3 と myfile_splitted.fa の2つのファイルが作られます。
DDBJ のアノテーションチェックによると =|>" [] といった文字は Entry として使えないとのことです。違反文字が含まれるときにはアノテーションの1列目エントリ名を正規化する（＝リネームする）必要があり、同梱のツール normalize-entry-namesが役立ちます。これはたとえば ERS324955|SC|contig000013 というエントリ名を ERS324955:SC:contig000013 に直します。
normalize-entry-names myannotation_output.annアノテーションファイルのエントリ名に正規化の必要があるときには myannotation_output_renamed.ann のファイルが作られます。無いときには Entry names are fine: No need to normalize. のメッセージが出て終了します。
/trans_splicingがあるときの位置補正およびFeaturejoin()/transl_exceptが端に来るときの位置補正/exceptionがあるときの/translation対応- 位置表記
123^124がフラットファイルに記載されるようなケースのGFF3側での表現・処理 - 現段階は仕様を固めているところなので、処理速度が後回しになっています
このプログラムの設計には、EMBL向けGFF3の変換ソフトである EMBLmyGFF3 のつくりを参考にさせていただきました。